Isopentenyldiphosphate (IPP)- bypass mevalonate pathways for isopentenol production
- 作者
- Aram Kang, Kevin W. George, George Wang, Edward Baidoo, Jay D. Keasling, Taek Soon Lee
- 单位
- Joint BioEnergy Institute; Biological Systems & Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley
- 杂志
- Metabolic Engineering（2016）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2015.12.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克服甲羟戊酸（MVA）途径生产异戊烯醇时对异戊烯基二磷酸（IPP）的依赖，避免IPP积累带来的毒性、能量浪费和内源调控干扰，提高途径效率和鲁棒性。
研究策略
利用磷酸甲羟戊酸脱羧酶（PMD）的混杂活性，设计两条IPP-bypass途径：途径I直接脱羧MVA生成异戊烯醇，途径II脱羧MVAP生成IP再经内源磷酸酶水解为异戊烯醇；并通过过表达AphA、定向进化PMD突变体、调整上游MVA合成模块等优化途径性能。
核心内容
本研究在大肠杆菌中设计了两种不依赖异戊烯基二磷酸（IPP）的甲羟戊酸（MVA）途径用于生产异戊烯醇，以规避IPP积累带来的毒性和能量浪费。途径I利用磷酸甲羟戊酸脱羧酶（PMD）直接脱羧MVA生成异戊烯醇，产量仅为0.85 mg/L；途径II则通过PMD脱羧MVAP生成异戊烯基磷酸（IP），再经内源磷酸酶AphA水解为异戊烯醇，产量达474.7 mg/L，为途径I的558倍，达到原途径的62.4%。过表达aphA后产量进一步提升至705 mg/L，较未过表达提高20%，达到原途径最大产量的83%。通过定向进化获得PMD突变体R74H，其kcat/Km为野生型的220%，体内产率从15.9 mg/L/h提升至20.4 mg/L/h。该途径对MVA水平和甲羟戊酸激酶表达不敏感，且在低通气条件下稳定性优于原途径。研究证明途径II是生产异戊烯醇的稳健替代方案，消除了IPP毒性并降低ATP需求，PMD活性是进一步提高产量的关键限速步骤。
创新点
首次设计了不依赖IPP的MVA途径用于异戊烯醇生产；鉴定AphA为催化IP去磷酸化的内源磷酸酶；发现PMD对MVAP的混杂活性并构建了活性提高的PMD突变体；证明该途径可降低ATP需求、规避IPP毒性、对MVA水平和MK表达不敏感，且在低通气条件下更具优势。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 | MVA途径（上游模块） | atoB | AtoB | 催化 | 乙酰-CoA乙酰转移酶，催化乙酰-CoA生成乙酰乙酰-CoA |
| Escherichia coli BW25113 | MVA途径（上游模块） | HMGS | HMGS | 催化 | HMG-CoA合酶，催化乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合生成HMG-CoA |
| Escherichia coli BW25113 | MVA途径（上游模块） | HMGR | HMGR | 催化 | HMG-CoA还原酶，催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸（MVA） |
| Escherichia coli BW25113 | IPP-bypass pathway II | MK | MK | 催化 | 甲羟戊酸激酶，催化MVA磷酸化生成MVAP |
| Escherichia coli BW25113 | IPP-bypass pathway II | PMD | PMDsc | 催化 | 磷酸甲羟戊酸脱羧酶（酿酒酵母），利用混杂活性脱羧MVAP生成IP；也可脱羧MVA（途径I） |
| Escherichia coli BW25113 | IPP-bypass pathway II | aphA | AphA | 催化 | 内源磷酸酶，水解IP为异戊烯醇 |
| Escherichia coli BW25113 | IPP-bypass pathway II | agp | Agp | 催化 | 内源磷酸酶，低活性水解IP，敲除后IP水解能力下降 |
| Escherichia coli BW25113 | IPP-bypass pathway II | yqaB | YqaB | 催化 | 内源磷酸酶，低活性水解IP |
| Escherichia coli BW25113 | 原MVA途径（pathway O） | PMK | PMK | 催化 | 磷酸甲羟戊酸激酶，催化MVAP磷酸化生成MVAPP |
| Escherichia coli BW25113 | 原MVA途径（pathway O） | nudB | NudB | 催化 | Nudix水解酶，水解IPP为IP，但不能进一步水解IP为异戊烯醇 |
| Escherichia coli BW25113 | PMD工程 | PMD | PMDsc-R74H | 催化 | PMD突变体，对MVAP的kcat/Km较野生型提高220%，体内产率提高至20.4 mg/L/h |
| Escherichia coli BW25113 | PMD工程 | PMD | PMDsc-I145F | 催化 | PMD突变体，对MVAP的kcat/Km为野生型的147%，但体内产量降低 |
| Escherichia coli BW25113 | PMD工程 | PMD | PMDsc-K22M | 催化 | PMD突变体，对MVAP的kcat/Km降低至野生型的25% |
| Escherichia coli BW25113 | PMD工程 | PMD | PMDsc-T209D | 催化 | PMD突变体，对MVAP的动力学参数与野生型相近 |
| Escherichia coli BW25113 | PMD工程 | PMDse | PMDse | 催化 | 来自表皮葡萄球菌的PMD，对MVAPP特异性高，但对MVAP活性低，体内产量仅11.3 mg/L |
| Escherichia coli BW25113 | PMD工程 | PMDhv | PMDhv | 催化 | 来自Haloferax volcanii的MVAP脱羧酶，在E. coli中未检测到活性 |
| Escherichia coli BW25113 | MVA途径（原） | idi | Idi | 催化 | IPP异构酶，将IPP转化为DMAPP，可能消耗碳流 |
关键发现
- ['途径I（MVA直接脱羧）产量为0.85±0.18 mg/L
- 途径II（MVAP脱羧）产量为474.7 mg/L，是途径I的558倍，达到原途径的62.4%。', '过表达aphA后产量提高至705 mg/L，比未过表达高20%，达到原途径最大产量836.9 mg/L的83%。', 'PMD对MVAP的kcat为0.14 s^-1，Km为0.99 mM
- R74H突变体的kcat/Km为野生型的220%，I145F为147%
- R74H突变体在体内产率为20.4 mg/L/h，高于野生型的15.9 mg/L/h。', '低通气条件下（30 rpm vs 200 rpm），途径O在16h仅保留22%产量，而途径II保留40%（16h）和60%（24h）。', 'MVAP可积累至100-200 mM而无明显毒性，而IPP积累30-60 mM即产生毒性。', '途径II对MVA水平（不同HMGS/HMGR组合）和MK表达水平不敏感，而途径O高度敏感。']
研究结论
本研究构建的IPP-bypass途径II是生产异戊烯醇的稳健替代方案，它消除IPP毒性、降低ATP需求，在低通气下表现更优，且PMD活性是关键限速步骤，进一步工程化PMD有望提高产量。