Production of a bioactive unnatural ginsenoside by metabolically engineered yeasts based on a new UDP-glycosyltransferase from Bacillus subtilis
- 作者
- Huichao Liang, Zongfeng Hu, Tingting Zhang, Ting Gong, Jingjing Chen, Ping Zhu, Yan Li, Jinling Yang
- 单位
- 天然药物生物活性物质与功能国家重点实验室及国家卫生和计划生育委员会天然产物生物合成重点实验室，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京100050，中国
- 杂志
- Metabolic Engineering（2017）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2017.07.008
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
天然人参皂苷中缺乏C12位糖基化修饰的化合物，化学半合成方法复杂、成本高且选择性差，难以规模化制备具有更高抗肿瘤活性的C12糖基化非天然人参皂苷。
研究策略
从枯草芽孢杆菌中鉴定新的UDP-糖基转移酶UGT109A1，解析其底物特异性和催化性能；将该酶与人参来源的达玛烯二醇合酶（DS）、原人参萜二醇合酶（PPDS）及拟南芥NADPH-细胞色素P450还原酶（ATR1）共同引入酿酒酵母，构建从头合成非天然人参皂苷3β,12β-Di-O-Glc-PPD的工程菌株，并通过过表达tHMG1增强前体供给。
核心内容
本研究从枯草芽孢杆菌中鉴定了一个新型UDP-糖基转移酶UGT109A1，该酶能够催化底物C3-OH、C12-OH和C20-OH位点的糖基化，可生成四种非天然人参皂苷，其中包括此前从未报道的新化合物3β,12β-Di-O-Glc-PPT。酶动力学分析显示，UGT109A1对12β-O-Glc-PPD的催化效率比对12β-O-Glc-PPT高近50倍。体外实验表明，3β,12β-Di-O-Glc-PPD对人肺癌NCI-H460细胞的IC50为84.6 μM，显著优于阳性对照Rg3的271.0 μM；体内Lewis肺癌模型中，5 mg/kg剂量的抑瘤率为49.69%，高于10 mg/kg Rg3的34.59%，与紫杉醇联用时抑瘤率可达64.64%。在此基础上，作者将该酶与达玛烯二醇合酶、原人参萜二醇合酶及拟南芥NADPH-细胞色素P450还原酶共同引入酿酒酵母，构建了非天然人参皂苷的从头合成途径，目标产物产量为6.17 mg/L，过表达tHMG1增强前体供给后产量提高至9.05 mg/L。该研究为具有更高抗肺癌活性的非天然皂苷类药物的微生物发酵生产提供了可行策略。
创新点
['首次报道能够催化C12-OH糖基化的UDP-糖基转移酶UGT109A1，同时具有C3-OH、C12-OH和C20-OH糖基化活性。', '发现了新化合物3β,12β-Di-O-Glc-PPT，此前从未被报道。', '首次在酿酒酵母中实现了非天然人参皂苷3β,12β-Di-O-Glc-PPD的从头合成。', '体内外实验表明3β,12β-Di-O-Glc-PPD具有比天然最强抗肺癌皂苷Rg3更高的抗肺癌活性。']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 甲羟戊酸途径及人参皂苷生物合成 | UGT109A1 | UDP-糖基转移酶UGT109A1 | 催化 | 来自Bacillus subtilis CTCC 63501，催化C3-OH、C12-OH、C20-OH位糖基化 |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 人参皂苷生物合成 | DS | 达玛烯二醇合酶 | 催化 | 来自Panax ginseng，催化2,3-氧化鲨烯环化生成达玛烯二醇-II |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 人参皂苷生物合成 | PPDS | 原人参萜二醇合酶（细胞色素P450） | 催化 | 来自Panax ginseng，催化达玛烯二醇-II的C12位羟化生成PPD |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | P450电子传递 | ATR1 | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 催化 | 来自Arabidopsis thaliana，为PPDS提供电子 |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 过表达增加2,3-氧化鲨烯前体供给，使产量由6.17 mg/L提高至9.05 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 甾醇生物合成调控 | UPC2.1 | 转录因子UPC2.1 | 调控 | 过表达UPC2.1导致菌株IN-C无法产生3β,12β-Di-O-Glc-PPD |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 甾醇生物合成 | ERG7 | 羊毛固醇合酶 | 催化 | 通过反义RNA技术下调其表达，将代谢流导向达玛烯二醇合成 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | UGT109A1 | 重组UGT109A1 | 催化 | 用于酶学表征及动力学研究 |
关键发现
- 鉴定出枯草芽孢杆菌来源的新UDP-糖基转移酶UGT109A1（GenBank KY952161），可分别将葡萄糖基转移至DM的C3-OH和C20-OH、PPD和PPT的C3-OH和C12-OH，生成4种非天然人参皂苷（3β-O-Glc-DM、3β,20S-Di-O-Glc-DM、3β,12β-Di-O-Glc-PPD、3β,12β-Di-O-Glc-PPT），其中3β,12β-Di-O-Glc-PPT为新化合物。酶动力学显示UGT109A1对12β-O-Glc-PPD的催化效率（kcat/Km=5.461 mM⁻¹·s⁻¹）比12β-O-Glc-PPT（0.116）高近50倍
- 对Rh2的kcat/Km为5.084。体外MTT实验表明，3β,12β-Di-O-Glc-PPD对人肺癌NCI-H460细胞的IC50为84.6 μM，显著低于阳性对照Rg3的271.0 μM。体内Lewis肺癌异种移植模型显示，5 mg/kg的3β,12β-Di-O-Glc-PPD抑瘤率为49.69%，高于10 mg/kg Rg3的34.59%
- 与15 mg/kg Taxol联用时抑瘤率达64.64%，优于Rg3+Taxol（53.39%）及Taxol单用（44.68%）。构建的工程酵母IN-A（含DS-GFP、PPDS、ATR1、UGT109A1）3β,12β-Di-O-Glc-PPD产量为6.17 mg/L，过表达tHMG1的IN-B产量提高到9.05 mg/L（1.47倍）
- IN-B中达玛烯二醇（DM）4.57 mg/L、PPD 11.45 mg/L、角鲨烯56.93 mg/L。过表达UPC2.1的IN-C未检测到目标产物。
研究结论
本研究鉴定了一个能催化C3、C12、C20位糖基化的多功能UDP-糖基转移酶UGT109A1，并利用代谢工程在酿酒酵母中建立了非天然人参皂苷3β,12β-Di-O-Glc-PPD的从头合成途径。该化合物在体内外均表现出优于天然人参皂苷Rg3的抗肺癌活性，且通过过表达tHMG1可显著提高产量，为抗肺癌药物发现和微生物发酵生产提供了新策略。