Enabling the synthesis of medium chain alkanes and 1-alkenes in yeast
- 作者
- Zhiwei Zhu, Yongjin J. Zhou, Min-Kyoung Kang, Anastasia Krivoruchko, Nicolaas A. Buijs, Jens Nielsen
- 单位
- Department of Biology and Biological Engineering, Chalmers University of Technology, Kemivägen 10, SE-41296 Gothenburg, Sweden; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Chalmers University of Technology, SE-41296 Gothenburg, Sweden; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark, DK-2970 Hørsholm, Denmark; Science for Life Laboratory, Royal Institute of Technology, SE-17121 Stockholm, Sweden
- 杂志
- Metabolic Engineering（2017）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2017.09.007
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中实现中链烷烃（C7-C13）和1-烯烃的从头合成，主要障碍是缺乏中链脂肪酸前体以及下游烃类合成酶活性低、副产物（脂肪醇）竞争等问题。
研究策略
工程化真菌I型脂肪酸合酶（FAS）以产生中链脂肪酸；筛选并改造脂肪酸醛脱甲酰氧合酶（ADO）以提高中链烷烃合成；将烷烃合成途径区室化到过氧化物酶体以减轻副产物形成；引入一步脱羧酶UndA将脂肪酸直接转化为1-烯烃。
核心内容
该研究在酿酒酵母中实现了中链烷烃（C7–C13）和1-烯烃的从头合成。首先通过真菌I型脂肪酸合酶（FAS）中嵌入异源硫酯酶并引入酮脂酰合酶域突变（G1250S、M1251W），结合敲除醛脱氢酶HFD1，使酵母产生中链脂肪酸前体。随后系统筛选13个脂肪醛脱甲酰氧合酶（ADO）同源物及突变体，鉴定出高效合成中链烷烃的TeADO，其A121F突变使庚烷和十一烷产量较野生型提高约100%。将烷烃合成途径靶向过氧化物酶体区室化后，中链烷烃产量较胞质途径提升63%–133%，并显著减少脂肪醇副产物。进一步引入一步脱羧酶UndA（Pput_3952），在20 g/L葡萄糖条件下1-烯烃产量达3.35 mg/L，较两步烷烃途径高25倍，且与文献报道的OleT产量相当但培养方式更简单。研究表明，工程化脂肪酸合酶结合下游途径区室化可有效解决中链烃合成的前体不足与副产物竞争问题，而UndA催化的脂肪酸一步脱羧路线为微生物生产汽油/航油范围烃类提供了更高效的策略。
创新点
['通过在FAS中嵌入异源硫酯酶并引入酮脂酰合酶域突变（G1250S、M1251W），使酵母产生中链脂肪酸', '系统筛选13个ADO同源物及V28F/A121F等突变，鉴定出TeADO等高效中链烷烃合成酶', '将烷烃合成途径靶向过氧化物酶体，显著提高中链烷烃产量并减少醇副产物', '首次在酵母中利用UndA实现中链1-烯烃的一步合成，产量比两步烷烃途径高25倍']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 脂肪酸合成 | FAS2 | 脂肪酸合酶（FAS） | 催化 | 工程化改造：嵌入异源硫酯酶并在Fas2引入G1250S/M1251W突变，以产生中链脂肪酸 |
| Saccharomyces cerevisiae | 脂肪酸合成 | thioesterase | 硫酯酶 | 催化 | 异源短链酰基-ACP/CoA硫酯酶嵌入FAS反应室，释放中链脂肪酸 |
| Saccharomyces cerevisiae | 烷烃合成 | MmCAR | 羧酸还原酶（CAR） | 催化 | 将游离脂肪酸还原为脂肪酸醛 |
| Saccharomyces cerevisiae | 烷烃合成 | npgA | 磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（NpgA） | 调控 | 激活CAR的翻译后修饰 |
| Saccharomyces cerevisiae | 烷烃合成 | TeADO | 脂肪醛脱甲酰氧合酶（ADO） | 催化 | 来自Thermosynechococcus elongatus，催化醛脱甲酰生成烷烃，活性优于SeADO |
| Saccharomyces cerevisiae | 烷烃合成 | EcFd, EcFNR | 铁氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP+还原酶 | 能量供给 | 来自大肠杆菌的电子传递系统，为ADO提供还原力 |
| Saccharomyces cerevisiae | 1-烯烃合成 | Pput_3952 | UndA脱羧酶 | 催化 | 非血红素铁氧化酶/脱羧酶，一步将脂肪酸转化为1-烯烃，底物偏好C10-C14 |
| Saccharomyces cerevisiae | 脂肪酸β-氧化 | POX1 | 酰基辅酶A氧化酶 | 催化 | 删除以阻止脂肪酸降解，提高中链脂肪酸积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 醛代谢 | HFD1 | 醛脱氢酶 | 催化 | 删除以避免脂肪酸醛氧化成脂肪酸，并提高细胞对中链脂肪酸的耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 烷烃合成（区室化） | PTS1信号 | 过氧化物酶体靶向信号肽 | 区室化 | 将CAR和ADO定位到过氧化物酶体，减少胞质醇脱氢酶对醛中间体的竞争 |
关键发现
['hfd1缺失显著增加中链脂肪酸产量，并部分缓解辛酸导致的生长抑制', 'SeADO的A121F突变使庚烷和十一烷产量比野生型提高约100%', '通过eTDH3p启动子表达TeADO，中链烷烃产量比初始SeADO+TEF1p提高250%', '过氧化物酶体区室化使中链烷烃产量比胞质途径提高100%（ZW202）、133%（ZW207）、63%（ZW2071）', '在ZW2071中表达UndA Pput_3952，5 g/L葡萄糖时产生2.25 mg/L 1-烯烃，20 g/L葡萄糖时达到3.35 mg/L（1.25 mg·L⁻¹·OD⁻¹），比烷烃产量高25倍', '直接添加2 mM抗坏血酸使1-烯烃产量降低32%，表明抗坏血酸类似物不是UndA的天然辅因子', '本研究中1-烯烃产量与文献报道的OleT在酵母中的产量（3.7 mg/L）相当，但培养方式更简单']
研究结论
通过工程化脂肪酸合酶提供中链脂肪酸前体，并结合下游烷烃或1-烯烃合成途径，成功在酿酒酵母中实现了中链烷烃和1-烯烃的从头合成。相比两步烷烃合成（醛中间体易被还原为醇），UndA催化的一步脱羧合成1-烯烃的路线更为高效，为微生物生产汽油/航油范围烃类提供了可行方案。