Enhancing erythritol productivity in Yarrowia lipolytica using metabolic engineering
- 作者
- Frédéric Carly, Marie Vandermies, Samuel Telek, Sébastien Steels, Stéphane Thomas, Jean-Marc Nicaud, Patrick Fickers
- 单位
- Unité de Biotechnologies et Bioprocédés, Université Libre de Bruxelles, Belgium; Microbial Processes and Interactions, TERRA Teaching and Research Centre, University of Liège - Gembloux Agro-Bio Tech, Belgium; Micalis Institute, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, 78350 Jouy-en-Josas, France
- 杂志
- Metabolic Engineering（2017）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2017.05.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）以甘油为底物生产赤藓糖醇的生产率受限于甘油同化、戊糖磷酸途径碳流分配以及产物分解代谢等问题，常规培养基优化方法提升有限。
研究策略
通过代谢工程过表达赤藓糖醇合成途径中的关键酶基因（GUT1、GUT2、TPI1、TKL1、YidA、ALR等），并敲除赤藓糖醇分解代谢关键基因EYK1，构建“推-拉”策略组合菌株以提高赤藓糖醇生产率。
核心内容
针对解脂耶氏酵母以甘油为底物生产赤藓糖醇时生产率受限的问题，该研究采用“推-拉”代谢工程策略改造菌株。一方面过表达甘油同化及赤藓糖醇合成途径关键酶基因（GUT1、GUT2、TPI1、TKL1、YidA、ALR），其中共表达GUT1与TKL1的组合策略属首次报道；另一方面敲除赤藓糖醇分解代谢关键基因EYK1，阻断产物再代谢。结果显示，共表达GUT1和TKL1的菌株FCY214在摇瓶中比生产速率较野生型提高65%（0.058 vs 0.035 g/gDCW·h），转化率达0.61 g/g；生物反应器中赤藓糖醇终浓度达79.4 g/L，生产率为0.84 g/L·h，较野生型（55.8 g/L，0.59 g/L·h）均提高42%。在此基础上敲除EYK1的FCY218菌株生产率进一步升至1.03 g/L·h，比野生型提高75%~78%，最大浓度达80.6 g/L，且达到最大浓度所需时间缩短40%。该组合策略有效提升了赤藓糖醇生产率，在廉价培养基下即可获得目前报道的最高生产率之一，为工业发酵提供了高效菌株。
创新点
首次在解脂耶氏酵母中采用GUT1与TKL1共表达的组合策略（推-拉策略），显著提高赤藓糖醇生产率；同时通过敲除EYK1阻断赤藓糖醇再代谢，进一步缩短发酵时间并提高产率。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | 甘油→赤藓糖醇合成途径 | GUT1 | 甘油激酶 (GK) | 催化 | 过表达提高甘油摄取速率，BamHI位点移除 |
| Yarrowia lipolytica | 甘油→赤藓糖醇合成途径 | GUT2 | 甘油-3P脱氢酶 (GDH) | 催化 | 单独过表达对赤藓糖醇生产率无显著提高，与GUT1共表达略有协同作用，BglII位点移除 |
| Yarrowia lipolytica | 甘油→赤藓糖醇合成途径 | TPI1 | 磷酸丙糖异构酶 (TIM) | 催化 | 过表达使赤藓糖醇产量提高5% |
| Yarrowia lipolytica | 甘油→赤藓糖醇合成途径（戊糖磷酸途径） | TKL1 | 转酮醇酶 (TK) | 催化 | 过表达使赤藓糖醇产量提高16%，转化率0.59 g/g；与GUT1共表达效果最佳，内含子及ClaI位点移除 |
| Yarrowia lipolytica | 甘油→赤藓糖醇合成途径 | YidA | 赤藓糖-4P磷酸酶 (E4PP) | 催化 | 来自大肠杆菌，过表达反而使赤藓糖醇产量降低（30 vs 35 g/L），可能因水解DHAP |
| Yarrowia lipolytica | 甘油→赤藓糖醇合成途径 | ALR | 赤藓糖还原酶 (ER) | 催化 | 来自Candida magnoliae，过表达未提高赤藓糖醇产量；密码子优化版本ALR_CO亦无显著效果 |
| Yarrowia lipolytica | 赤藓糖醇分解代谢途径 | EYK1 | 赤藓酮糖激酶 (EK) | 催化 | 敲除后菌株不能消耗赤藓糖醇，防止产物再代谢，使生产率进一步提高至1.03 g/L.h |
关键发现
- 摇瓶培养中，共表达GUT1和TKL1的FCY214菌株赤藓糖醇比生产速率较野生型提高65%（0.058 vs
- 035 g/gDCW.h），转化率提高至0.61 g/g；生物反应器中FCY214赤藓糖醇终浓度达79.4 g/L，生产率为0.84 g/L.h，较野生型（55.8 g/L
- 59 g/L.h）分别提高42%和42%；进一步敲除EYK1的FCY218菌株生产率达1.03 g/L.h，比野生型提高75%（摘要）/78%（结论），最大赤藓糖醇浓度80.6 g/L，达到最大浓度所需时间缩短40%。
研究结论
过表达GUT1和TKL1并敲除EYK1可显著提高解脂耶氏酵母以甘油为底物的赤藓糖醇生产率，且使用廉价培养基即可获得目前报道的最高赤藓糖醇生产率之一，为赤藓糖醇工业发酵提供高效菌株。