Over expression of GroESL in Cupriavidus necator for heterotrophic and autotrophic isopropanol production
- 作者
- Jillian Marc, Estelle Grousseau, Eric Lombard, Anthony J. Sinskey, Nathalie Gorret, Stéphane E. Guillouet
- 单位
- LISBP, Université de Toulouse, CNRS, INRA, INSA, 135 avenue de Rangueil, 31077 Toulouse CEDEX 04, France; Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 77 Massachusetts avenue, Cambridge, MA 02139, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2017）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2017.05.007
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在Cupriavidus necator中提高异丙醇产量，克服异丙醇对细胞生长的毒性抑制（临界浓度15 g/L），并在异养和自养条件下实现高效生产。
研究策略
鉴定并过表达C. necator内源的groESL分子伴侣基因，以提高菌株对异丙醇的耐受性；在最佳异丙醇生产菌株中共表达groESL，增强异丙醇合成途径中异源酶（ADC和ADH）的稳定性与活性，从而促进碳流转向异丙醇；同时评估异养（果糖）和自养（CO2/H2）条件下的生产性能。
核心内容
该研究在Cupriavidus necator中鉴定并过表达了内源groESL分子伴侣基因，以缓解异丙醇对菌株生长的毒性抑制并提高产量。作者在异丙醇生产菌株Re2133中共表达groESL，发现其将异丙醇临界耐受浓度从15 g/L提升至20 g/L，且最大比生长速率的降幅减少24%。在果糖补料分批培养中，过表达菌株Re2133/pEG23最终异丙醇浓度达9.8 g/L（考虑蒸发相当于16 g/L），较对照提高7%，总转化率提升9%至0.174 g/g，副产物丙酮产量降低21%。机制上，GroESL增强了异丙醇合成途径中异源酶ADC和ADH的稳定性与活性，并将膜损伤细胞比例控制在10%以下。在自养条件下以CO2为唯一碳源，该菌株12小时内可产250 mg/L异丙醇，比生产速率为果糖培养的约60%。这一策略证明分子伴侣过表达能同时改善耐受性和异源酶功能，为C. necator作为从CO2生产化学品的工业平台提供了可行路径。
创新点
['首次在C. necator中鉴定并过表达内源groESL基因，显著提高菌株对异丙醇的耐受性（临界浓度从15 g/L提高到20 g/L）', '在异丙醇生产菌株中过表达groESL，最终异丙醇浓度达到9.8 g/L（考虑蒸发相当于16 g/L），产量提高9%-18%', '证明了过表达GroESL可稳定异源酶ADC和ADH的活性，促进丙酮向异丙醇的转化，降低副产物丙酮产量', '首次在自养条件下（CO2为唯一碳源）实现异丙醇生产，12小时内产量达250 mg/L']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cupriavidus necator Re2133 (Ralstonia eutropha H16 ΔphaB1B2B3C1) | 异丙醇合成途径（乙酰-CoA → 乙酰乙酰-CoA → 丙酮 → 异丙醇） | groES (H16_A0705), groEL (H16_A0706) | GroES, GroEL | 调控 | 分子伴侣，过表达可增强蛋白折叠稳定性，提高菌株对异丙醇的耐受性 |
| Cupriavidus necator Re2133 (Ralstonia eutropha H16 ΔphaB1B2B3C1) | 异丙醇合成途径 | phaA | β-酮硫解酶（THL） | 催化 | 将乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA |
| Cupriavidus necator Re2133 (Ralstonia eutropha H16 ΔphaB1B2B3C1) | 异丙醇合成途径 | ctfAB (H16_A1331, H16_A1332) | 辅酶A转移酶（CTF） | 催化 | 将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸 |
| Cupriavidus necator Re2133 (Ralstonia eutropha H16 ΔphaB1B2B3C1) | 异丙醇合成途径 | adc* | 乙酰乙酸脱羧酶（ADC） | 催化 | 异源基因，将乙酰乙酸脱羧为丙酮 |
| Cupriavidus necator Re2133 (Ralstonia eutropha H16 ΔphaB1B2B3C1) | 异丙醇合成途径 | adh* | 醇脱氢酶（ADH） | 催化 | 异源基因，将丙酮还原为异丙醇 |
| Cupriavidus necator Re2133 (Ralstonia eutropha H16 ΔphaB1B2B3C1) | PHA合成途径 | phaB1B2B3C1 | PHA合成相关蛋白 | 催化 | 敲除该基因以阻断PHA合成，将碳流导向异丙醇 |
关键发现
- ['过表达groESL使菌株在异丙醇存在下的最大比生长速率降低幅度减少24%（0.050 h⁻¹/g异丙醇 vs
- 065 h⁻¹/g异丙醇），临界异丙醇浓度从15 g/L提高到20 g/L', '在果糖补料分批培养中，过表达groESL的菌株Re2133/pEG23最终异丙醇浓度达9.8 g/L（考虑蒸发后相当于16 g/L），较对照菌株Re2133/pEG7c（8.5 g/L）提高7%', '过表达groESL使异丙醇总转化率提高9%（0.174 g/g vs
- 159 g/g），最大转化率提高12%（0.187 g/g vs
- 159 g/g），丙酮产量降低21%', '最大异丙醇比生产速率从0.036 g/(g·h)提高到0.047 g/(g·h)，提高约30%', '在自养条件下（CO2为唯一碳源），Re2133/pEG23菌株在12小时内产生250 mg/L异丙醇，最大比生产速率为0.035 Cmol/(Cmol·h)，为果糖培养条件下的约60%', '过表达groESL后，异丙醇合成途径中的异源酶ADC和ADH的酶活水平显著提高，尤其在培养后期，膜损伤细胞比例保持在10%以下（对照菌株最高达20%）']
研究结论
过表达C. necator内源groESL基因能显著提高菌株对异丙醇的耐受性，并在异丙醇生产菌株中促进异源酶的稳定和活性，从而提高异丙醇产量（+7%）和转化率（+9%-18%），同时降低副产物丙酮。该策略在自养条件下也证明有效，12小时可生产250 mg/L异丙醇，表明C. necator作为从CO2生产化学品平台的巨大潜力。