Isolation and Functional Characterization of Carotenoid Cleavage Dioxygenase-1 from Laurus nobilis L. (Bay Laurel) Fruits
- 作者
- Mosaab Yahya, Anna Berim, Tal Isaacson, Sally Marzouk, Einat Bar, Rachel Davidovich-Rikanati, Efraim Lewinsohn, Mwafaq Ibdah
- 单位
- NewYear Research Center, Agriculture Research Organization, P.O. Box 1021, Ramat Yishay 30095, Israel; Institute of Biological Chemistry, Washington State University, P.O. Box 646340, Pullman, Washington 99164-6340, United States
- 杂志
- Journal of Agricultural and Food Chemistry（2015）
- DOI
- 10.1021/acs.jafc.5b02941
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
月桂果实中类胡萝卜素裂解产生挥发性降异戊二烯（norisoprenoid）的分子机制尚不清楚，特别是LnCCD1在其中的作用。
研究策略
通过同源克隆从月桂果实中分离LnCCD1 cDNA，在大肠杆菌中异源表达，利用积累不同类胡萝卜素的工程菌株测定其裂解活性，结合HPLC/GC-MS分析果实中类胡萝卜素和挥发物，并用实时PCR分析基因表达。
核心内容
该研究从月桂果实中克隆并功能表征了类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LnCCD1。通过在大肠杆菌中异源表达该酶，并利用积累不同类胡萝卜素（番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素、δ-胡萝卜素）的工程菌株测定其裂解活性，同时结合HPLC/GC-MS分析果实中类胡萝卜素和挥发性物质组成，以及实时PCR检测基因表达水平。结果表明，绿果中总类胡萝卜素含量为188.41 μg/g FW，约为黑果（130.32 μg/g FW）的2倍；但黑果中仅检测到6-甲基-5-庚烯-2-酮、假紫罗酮和β-紫罗酮等降异戊二烯挥发物，绿果中未检出。LnCCD1在黑果中的表达量是绿果的6倍。体外酶活测定证实LnCCD1具有9,10和5,6双键裂解活性，能作用于多种底物产生相应香气化合物，例如在积累番茄红素的菌株中检测到6-甲基-5-庚烯-2-酮36.05 ng/mL和假紫罗酮26.57 ng/mL。这证明LnCCD1是一种广谱底物酶，在月桂果实成熟过程中高水平表达，对该果实风味和香气的形成起关键作用。
创新点
首次从月桂果实中克隆并功能表征LnCCD1，证明其具有9,10和5,6双键裂解活性，能够产生多种重要香气化合物。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素裂解 | LnCCD1 | LnCCD1 | 催化 | 重组蛋白在大肠杆菌中异源表达，可裂解多种类胡萝卜素底物 |
| Laurus nobilis | 类胡萝卜素裂解 | LnCCD1 | LnCCD1 | 催化 | 在月桂果实中表达，黑果中表达量是绿果的6倍，参与norisoprenoid香气形成 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ等（通过质粒pBCAR-EB, pBCAR-EBI, pBCAR-EBIY, pDCAR, pZEAX引入） | 类胡萝卜素合成酶系 | 催化 | 工程菌株用于积累番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素、δ-胡萝卜素等底物，用于LnCCD1活性测定 |
关键发现
- 黑果中总类胡萝卜素含量为130.32 μg/g FW，绿果为188.41 μg/g FW，绿果约为黑果的2倍；黑果中β-胡萝卜素13.70±1.4 μg/g FW、叶黄素33.07±3.67 μg/g FW、玉米黄素0.20±0.05 μg/g FW等；黑果中仅检测到6-甲基-5-庚烯-2-酮（51.2±5.1 ng/g FW）、假紫罗酮（48.7±14.9 ng/g FW）和β-紫罗酮（31.6±0.9 ng/g FW），绿果中未检测到这些norisoprenoids；LnCCD1在黑果中的表达量是绿果的6倍；体外酶活测定：在积累番茄红素的大肠杆菌中检测到MHO
- 05±3.17 ng/mL、假紫罗酮26.57±1.08 ng/mL；在积累β-胡萝卜素的菌株中检测到MHO
- 08±0.91 ng/mL、假紫罗酮1.36±0.33 ng/mL、β-紫罗酮22.51±4.61 ng/mL；在积累玉米黄素的菌株中检测到MHO
- 04±2.12 ng/mL、假紫罗酮4.92±0.29 ng/mL、β-紫罗酮5.46±0.86 ng/mL；在积累δ-胡萝卜素的菌株中检测到MHO
- 07±1.50 ng/mL、假紫罗酮11.88±0.64 ng/mL、α-紫罗酮1.56±0.12 ng/mL。
研究结论
LnCCD1是一种广谱底物类胡萝卜素裂解双加氧酶，在月桂黑果中高表达，主要产生6-甲基-5-庚烯-2-酮、假紫罗酮、β-紫罗酮和α-紫罗酮，对月桂果实风味和香气形成起重要作用。