Hyperproduction of β-Glucanase Exg1 Promotes the Bioconversion of Mogrosides in Saccharomyces cerevisiae Mutants Defective in Mannoprotein Deposition
- 作者
- Reuben Wang, Pei-Yin Lin, Shyue-Tsong Huang, Chun-Hui Chiu, Ting-Jang Lu, Yi-Chen Lo
- 单位
- Institute of Food Science and Technology, National Taiwan University; College of Bioresources and Agriculture, Joint Center for Instruments and Researches, National Taiwan University; Food Industry Research Development Institute, Bioresource Collection and Research Center
- 杂志
- Journal of Agricultural and Food Chemistry
- DOI
- 10.1021/acs.jafc.5b03909
- 所属领域
- 代谢工程 / 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明酿酒酵母kre6Δ突变体高效将罗汉果苷V转化为罗汉果苷IIIE的分子机制
研究策略
比较多种细胞壁结构缺陷突变体的罗汉果苷生物转化特性，结合透射电镜、溶壁酶敏感性、甘露蛋白释放检测及Exg1分泌与表达分析
核心内容
该研究通过比较多种酿酒酵母细胞壁缺陷突变体，阐明了kre6Δ突变体高效转化罗汉果苷V为罗汉果苷IIIE的分子机制。研究发现，甘露蛋白沉积缺陷（如kre1Δ、las21Δ、gas1Δ、kre6Δ）而非一般细胞壁缺陷（如cwh41Δ、cwh43Δ）可显著促进生物转化，其中kre6Δ胞外蛋白比活和体积活分别达220 U/mg和112 U/mL，远高于野生型的77 U/mg和35 U/mL。机制分析表明，kre6Δ细胞壁外层甘露蛋白锚定缺陷导致细胞壁完整性和孔隙率改变，溶壁酶裂解延滞时间仅0.29 min（野生型为6.99 min），使Exg1等胞外酶大量泄漏至培养基，其胞外Exg1-3HA量为野生型的1.67倍。24小时发酵后kre6Δ培养物中罗汉果苷IIIE占总量55%（野生型为39%）。这一发现揭示了甘露蛋白沉积缺陷作为通用宿主策略的潜力，可通过增强胞外酶泄漏提高糖基化活性化合物的生物转化效率。
创新点
首次发现甘露蛋白沉积缺陷（如kre1Δ、las21Δ、gas1Δ、kre6Δ）而非一般细胞壁缺陷可导致Exg1过量泄漏并显著促进糖基化活性化合物的生物转化
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 细胞壁β-葡聚糖与甘露蛋白生物合成 | KRE6 | Kre6 | 催化 | 编码β-1,6-葡聚糖合酶，其缺失导致β-1,6-葡聚糖减少、细胞壁甘露蛋白沉积缺陷并促进Exg1泄漏 |
| Saccharomyces cerevisiae | β-葡聚糖降解/罗汉果苷生物转化 | EXG1 | Exg1 | 催化 | 外切-1,3-β-葡聚糖酶，负责将罗汉果苷V水解为罗汉果苷IIIE；在kre6Δ突变体中大量分泌至胞外 |
| Saccharomyces cerevisiae | 细胞壁β-1,6-葡聚糖外部链延伸 | KRE1 | Kre1 | 催化 | 参与β-1,6-葡聚糖外链延伸，缺失后增加甘露蛋白释放和Exg1泄漏，提高MG转化效率 |
| Saccharomyces cerevisiae | GPI锚定生物合成 | LAS21 | Las21/Gpi7 | 催化 | 编码GPI锚结构合成酶，缺失导致GPI锚定甘露蛋白减少，增强细胞壁通透性和MG转化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 细胞壁β-1,3-葡聚糖修饰 | GAS1 | Gas1 | 催化 | 参与细胞壁β-1,3-葡聚糖修饰和蛋白锚定，缺失导致蛋白质和葡聚糖释放增加，促进Exg1泄漏 |
| Saccharomyces cerevisiae | 细胞壁β-1,6-葡聚糖组装 | CWH41 | Cwh41 | 催化 | 编码α-葡萄糖苷酶，参与β-1,6-葡聚糖合酶糖基化修饰，其缺失未显著影响MG转化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 细胞壁生物合成 | CWH43 | Cwh43 | 转运 | 推定传感器/转运蛋白，缺失导致细胞壁增厚但不增强MG转化，作为对照 |
关键发现
- kre6Δ突变体胞外蛋白比活和体积活分别达220 U/mg和112 U/mL，而野生型为77 U/mg和35 U/mL
- 24 h发酵后kre6Δ培养物中MG III E占MG总量55%（野生型为39%）
- kre6Δ胞外Exg1-3HA量是野生型的1.67倍，胞外/胞内Exg1比值平均高2.3倍
- kre6Δ胞外蛋白释放量约为野生型的2倍
- kre1Δ突变体MG III E占比约51%，gas1Δ和las21Δ约61%，野生型与cwh41Δ、cwh43Δ约39-40%
- kre6Δ和kre1Δ释放的多糖浓度分别为164.71和156.81 mg/L，均显著高于野生型96.96 mg/L
- kre6Δ的溶壁酶裂解延滞时间LT=0.29 min，远短于野生型6.99 min。
研究结论
酵母细胞壁外层甘露蛋白锚定缺陷导致细胞壁完整性下降和孔隙率增加，使Exg1等胞外酶大量泄漏到培养基中，从而显著促进罗汉果苷V向罗汉果苷IIIE的生物转化；此类甘露蛋白沉积缺陷突变体可作为糖基化活性化合物生物转化的通用宿主。