Fine-Tuning the Function of Farnesene Synthases for Selective Synthesis of Farnesene Stereoisomers
- 作者
- Shengli Wang, Jiahui Zhou, Chuanling Zhan, Jianjun Qiao, Qinggele Caiyin, Meilan Huang
- 单位
- School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University; Zhejiang Shaoxing Research Institute of Tianjin University; School of Chemistry & Chemical Engineering, Queen's University Belfast
- 杂志
- Journal of Agricultural and Food Chemistry（2024）
- DOI
- 10.1021/acs.jafc.4c09515
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
β-法尼烯合酶催化产生β-法尼烯是维生素E生物合成的关键步骤，但植物来源产量低且酶结构未知，缺乏理性改造依据，导致β-法尼烯产量无法满足工业化需求。
研究策略
结合AlphaFold3结构预测、分子对接和分子动力学模拟解析青蒿β-法尼烯合酶（AaFS）的底物结合模式与催化口袋，通过结构引导的定点突变改造活性位点及远端保守突变位点（CbD）提升产量，并利用关键残基突变调控产物特异性。
核心内容
本研究采用AlphaFold3结构预测、分子对接与分子动力学模拟，解析了青蒿β-法尼烯合酶（AaFS）的底物结合模式与催化口袋，据此开展结构引导的定点突变以提升β-法尼烯产量并调控产物选择性。在酿酒酵母中，突变体L326I和M433I使β-法尼烯产量分别达3877.42 mg/L和2961.13 mg/L，较野生型（450.65 mg/L）提高8.6倍和6.6倍，其中L326I的kcat/KM较野生型提升3.3倍。关键残基功能解析揭示，W299是控制α/β-法尼烯异构体选择性的开关，W299C突变可同时产生两种异构体；Y402则决定线性产物向单环α-红没药醇的转化，Y402A突变通过引入水通道改变产物谱。远端保守位点Q142H突变亦使产量提高3倍。该工作为法尼烯合酶的结构-功能关系提供了分子层面的认识，所获得的高产突变体及选择性调控机制为维生素E前体的工业化生物合成奠定了酶工程基础。
创新点
['采用AlphaFold3结合MD模拟首次获得合理AαFS催化口袋模型，为酶工程提供结构基础', '鉴定L326I和M433I显著提高β-法尼烯产量，L326I较野生型提高8.6倍', '揭示W299为控制α/β-法尼烯异构体的关键残基，Y402为控制线性产物向单环α-红没药醇转化的关键残基']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae SC0277 | 甲羟戊酸（MVA）通路 | AaFS | β-法尼烯合酶（来源于青蒿 Artemisia annua） | 催化 | 体内表达生产β-法尼烯，产量从450.65 mg/L提高到3877.42 mg/L（L326I） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 蛋白质异源表达 | AaFS（含突变体） | β-法尼烯合酶及突变体 | 催化 | 用于纯酶动力学测定，L326I催化效率为野生型的3.3倍 |
| — | 倍半萜生物合成 | Fsso | α-法尼烯合酶（来源于大豆） | 催化 | 与AaFS比较揭示W299/C293对应位点控制产物异构体选择性 |
| — | FPP转化为法尼烯 | AaFS-W299C（及W299系列突变） | β-法尼烯合酶突变体 | 催化 | W299C减少位阻使底物采用不同构象，同时产生α-法尼烯（6.68 mg/L）和β-法尼烯（10.55 mg/L） |
| — | FPP环化途径 | AaFS-Y402A | β-法尼烯合酶突变体 | 催化 | Y402A创造空间并引入水通道，使产物从线性法尼烯转为单环α-红没药醇等 |
| — | MVA通路 | AaFS-Q142H | β-法尼烯合酶突变体 | 催化 | CbD位点突变，β-法尼烯产量提高3倍 |
关键发现
- 野生型AaFS β-法尼烯产量为450.65 mg/L，突变体L326I、M433I、V467I产量分别为3877.42 mg/L、2961.13 mg/L、767.65 mg/L，分别提高8.6倍、6.6倍、1.7倍。动力学参数显示L326I的kcat/KM为40.4×10^-3 μM^-1s^-1，较野生型12.1×10^-3提高3.3倍
- M433I为32.6×10^-3。W299C突变同时产生α-法尼烯（6.68 mg/L）和β-法尼烯（10.55 mg/L），而Fssso的C293W突变只产生β-法尼烯。Y402A突变引入水通道，使产物从线性法尼烯转为单环产物（α-红没药醇、zingiberenol等进行）。CbD位点Q142H使产量提高3倍。
研究结论
本研究通过结构引导的酶工程解析了AaFS的催化机制，成功实现β-法尼烯高产（L326I达3877.42 mg/L），并阐明了W299和Y402对产物选择性（α/β异构体及线性/环化产物）的分子基础，为法尼烯合酶理性工程化及维生素E的工业生物合成提供了重要依据。