Mechanism of Allosteric Inhibition of the Enzyme IspD by Three Different Classes of Ligands
- 作者
- Anatol Schwab, Boris Illarionov, Annika Frank, Andrea Kunfermann, Michael Seet, Adelbert Bacher, Matthias C. Witschel, Markus Fischer, Michael Groll, François Diederich
- 单位
- Laboratorium für Organische Chemie, ETH Zurich; Hamburg School of Food Science, Universität Hamburg; Center for Integrated Protein Science Munich, Lehrstuhl für Biochemie, Technische Universität München; BASF SE
- 杂志
- ACS Chemical Biology（2017）
- DOI
- 10.1021/acschembio.7b00004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明拟南芥IspD酶受三类不同配体变构抑制的分子机制，并为开发新型除草剂和抗除草剂作物提供理论基础。
研究策略
通过X射线共晶结构解析、定点突变、酶动力学分析和抑制活性测定，结合不同配体的结构-活性关系研究，揭示变构位点loop的构象变化及关键残基的作用。
核心内容
该研究通过X射线共晶结构解析、定点突变和酶动力学分析，阐明了拟南芥IspD酶受三类不同配体变构抑制的分子机制。研究人员首次发现苯基异噁唑类化合物4是新型AtIspD变构抑制剂，其IC50为9.3±0.6 μM，共晶结构显示该化合物通过卤键和氢键网络结合于变构位点。变构抑制的分子机制涉及loop区域（Gly256-Asp262）的构象变化，其中Asp262是关键残基：D262A突变使唑并嘧啶类抑制剂2的IC50从0.029 μM增至23 μM（约793倍），同时对化合物4也产生显著抗性。此外，E258A突变降低了酶活性（kcat从13 min-1降至3.9 min-1）。研究还发现代谢下游产物DMAPP和IPP是IspD的天然反馈抑制剂（IC50分别为2.5 mM和19 mM），但作用机制独立于变构位点。这些发现不仅揭示了IspD变构抑制的精细机制，获得的抗性突变酶还为设计抗除草剂作物提供了概念性依据。
创新点
首次报道了苯基异噁唑类新的变构抑制剂及其结合模式；通过晶体结构和突变研究揭示了Asp261/Asp262在变构抑制中的关键作用；获得了对特定唑并嘧啶类抑制剂选择性抗性的突变酶，为设计抗除草剂作物提供了新思路；发现代谢下游产物IPP和DMAPP是IspD的天然反馈抑制剂，但不结合于变构位点。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | 非甲羟戊酸途径（MEP途径） | ispD | IspD | 催化 | 4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶（EC 2.7.7.60），来源为拟南芥（Arabidopsis thaliana） |
| — | 非甲羟戊酸途径（MEP途径） | ispD(D262A) | IspD D262A突变体 | 催化 | 天冬氨酸262突变为丙氨酸，导致酶活性显著降低（kcat=0.78±0.05 min-1），对唑并嘧啶类和苯基异噁唑类抑制剂产生抗性 |
| — | 非甲羟戊酸途径（MEP途径） | ispD(E258A) | IspD E258A突变体 | 催化 | 谷氨酸258突变为丙氨酸，apo状态下变构环呈部分开放构象，酶活性降低（kcat=3.9±0.3 min-1），对唑并嘧啶类抑制剂的敏感性下降 |
关键发现
- 苯基异噁唑4是新的AtIspD变构抑制剂，IC50为9.3±0.6 μM，且不受Cd2+影响
- 共晶结构（PDB 5MRM，1.8 Å）显示其通过卤键和氢键网络结合于变构位点。变构抑制通过loop区域（Gly256-Asp262）的构象变化实现，其中D262A突变使唑并嘧啶2的IC50从0.029±0.002 μM提高到23±1 μM（约793倍），而D262A对4的IC50为247±9 μM，表明突变体对4也有抗性。E258A突变使酶活性降低（kcat=3.9±0.3 min-1 vs 野生型13±1 min-1），且对1和2的抑制减弱。另外，天然产物DMAPP和IPP对AtIspD有反馈抑制，IC50分别为2.5 mM和19 mM，但不结合变构位点。
研究结论
研究阐明了AtIspD变构抑制的详细机制，关键残基Asp262/Asp261通过空间位阻和电荷排斥干扰底物结合；突变研究证实了唑并嘧啶类抑制剂的作用依赖于Asp262，而E258A突变导致变构环部分打开。获得的抗性突变酶为开发抗除草剂作物提供了概念性依据。DMAPP和IPP作为反馈调节剂，其抑制机制独立于变构位点。