Switching the Regioselectivity of a Cyclohexanone Monooxygenase toward (+)-trans-Dihydrocarvone by Rational Protein Design
- 作者
- Kathleen Balke, Sandy Schmidt, Maika Genz, Uwe T. Bornscheuer
- 单位
- Institute of Biochemistry, Dept. of Biotechnology & Enzyme Catalysis, Greifswald University, 17487 Greifswald, Germany
- 杂志
- ACS Chemical Biology（2016）
- DOI
- 10.1021/acschembio.5b00723
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过理性蛋白质设计改变环己酮单加氧酶的区域选择性，使(+)-反式二氢香芹酮的氧化产物从异常内酯完全转变为正常内酯。
研究策略
基于同源建模和分子对接，逐步突变活性位点氨基酸，筛选关键突变并组合，随后将有利突变转移到同源酶CHMO_Acineto中验证。
核心内容
本研究通过理性蛋白质设计，成功将环己酮单加氧酶CHMO_Arthro对(+)-反式二氢香芹酮的区域选择性从完全生成异常内酯切换为正常内酯。作者基于同源建模和分子对接，逐步突变活性位点氨基酸，发现单突变F299A可产生59%正常内酯，双突变F299A/F330A提高至86%，而三突变F299A/F330A/F485A在小规模全细胞反应中实现99%正常内酯（99:1），野生型则为0%。该方法还成功跨酶转移：将相应三突变引入CHMO_Acineto后，正常内酯比例达99.6%，而该酶野生型本身偏好异常内酯（97.6%）。结果表明，通过重塑活性位点空间使底物以倒置方向结合，可彻底改变Baeyer-Villiger单加氧酶的区域选择性，为同类酶的定向改造提供了基于结构的有效设计策略。
创新点
首次实现了Baeyer-Villiger单加氧酶区域选择性的完全切换；通过设计三突变体使产物从100%异常内酯变为99%正常内酯；证明该方法可跨同源酶转移。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | Baeyer-Villiger氧化 | — | CHMO_Arthro（来自Arthrobacter sp. BP2） | 催化 | 野生型及突变体（F299A/F330A/F485A等） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Baeyer-Villiger氧化 | — | CHMO_Acineto（来自Acinetobacter sp.） | 催化 | 野生型及三突变体F246V/F277A/F432A |
| — | Baeyer-Villiger氧化 | — | CHMO_Rhod（来自Rhodococcus sp. HI-31） | 催化 | 作为同源建模模板，未在本研究中表达 |
关键发现
- 野生型CHMO_Arthro对(+)-trans-二氢香芹酮完全生成异常内酯（0:100）
- 单突变F299A产生59%正常内酯
- 双突变F299A/F330A产生86%正常内酯
- 三突变F299A/F330A/F485A在小规模全细胞反应中生成99%正常内酯（99:1），野生型为0%正常内酯
- CHMO_Acineto对应三突变F246V/F277A/F432A生成99.6%正常内酯，野生型生成97.6%异常内酯。野生型CHMO_Arthro最适pH为7.3，最适温度43°C，高于6mM底物发生底物抑制
- 30°C下4小时完全失活，25°C下4小时保留50%活性，20°C下43小时保留50%活性。全细胞反应中，2mM底物时野生型1-1.5小时完全转化，三突变4-5小时达98%正常内酯
- 6mM底物时三突变转化率97%，正常内酯>99%。纯化酶（2mg）转化2mM底物，野生型<30分钟，三突变约150小时。
研究结论
通过重塑活性位点空间，使底物以倒置方向结合，成功将区域选择性从异常内酯完全切换到正常内酯，并证明了基于结构的理性设计在BVMO区域选择性改造中的有效性。