Genetic and molecular basis of botrydial biosynthesis. Connecting cytochrome P450-encoding genes to biosynthetic intermediates.
- 作者
- Javier Moraga, Bérengère Dalmais, Inmaculada Izquierdo-Bueno, Josefina Aleu, James R. Hanson, Rosario Hernández-Galán, Muriel Viaud, Isidro G. Collado
- 单位
- Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias, Universidad de Cádiz, 11510 Puerto Real, Cádiz. Spain.; UMR BIOGER, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, 78850 Thiverval-Grignon, France.; Department of Organic Chemistry, University of Sussex, Brighton, Sussex, BN1 9QJ, United Kingdom.
- 杂志
- ACS Chemical Biology（2017）
- DOI
- 10.1021/acschembio.6b00581
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明灰霉菌 Botrytis cinerea 中植物毒素 botrydial 生物合成基因簇中五个基因的功能，特别是细胞色素 P450 单加氧酶 BcBOT3 和 BcBOT4 催化的特异性羟基化步骤，从而建立完整的生物合成途径。
研究策略
采用同源重组基因敲除技术分别失活 BcBOT3 和 BcBOT4 基因，构建突变体，在固体麦芽琼脂培养基上发酵，提取代谢产物，通过色谱技术纯化，并用 NMR 和质谱鉴定结构，根据积累的中间体推断酶催化功能。
核心内容
该研究通过同源重组基因敲除技术，在灰霉菌B05.10中分别失活了botrydial生物合成基因簇中的BcBOT3和BcBOT4两个细胞色素P450单加氧酶基因，结合发酵产物提取、色谱纯化及NMR和质谱结构鉴定，阐明了这两个基因在生物合成途径中的催化功能。结果显示，bcbot3Δ突变体不产生botrydial，积累中间体4β-acetoxy-15α-hydroxyprobotryane达35 mg/L，并分离到新化合物4β-hydroxyprobotryan-15-one，表明BcBOT3催化PSP骨架C-10的立体专一性羟基化；bcbot4Δ突变体同样丧失botrydial合成能力，积累probotryane，且大量产生聚酮类化合物，包括已知的botrylatone、botcinins系列及两个新聚酮cinbotolide B和C，证实BcBOT4负责C-4羟基化。结合已有BcBOT1、BcBOT2和BcBOT5的功能，研究建立了从法尼基焦磷酸到botrydial的完整生物合成途径，并发现BcBOT4缺失引起的聚酮过量产生暗示该基因在代谢调控中具有潜在作用，为真菌毒素合成调控机制提供了新见解。
创新点
首次确定 BcBOT3 和 BcBOT4 分别催化 presilipherfolan-8β-ol 骨架 C-10 和 C-4 的立体专一性羟基化；发现 bcbot4Δ 突变体过量产生聚酮类化合物，并分离鉴定出两个新 botrylactone 和两个新 cinbotolide（B 和 C）；提出了完整的 botrydial 生物合成途径及 C-10:C-15 键裂解的可能机制。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Botrytis cinerea B05.10 | botrydial 生物合成 | BcBOT1 | BcBOT1（细胞色素P450单加氧酶） | 催化 | 催化 C-15 羟基化，由中间体 2d 生成 2e，并可能参与 C-10:C-15 键裂解 |
| Botrytis cinerea B05.10 | botrydial 生物合成 | BcBOT2 | BcBOT2（倍半萜环化酶） | 催化 | 催化 FPP 环化生成 presilipherfolan-8β-ol (PSP, 2a) |
| Botrytis cinerea B05.10 | botrydial 生物合成 | BcBOT3 | BcBOT3（细胞色素P450单加氧酶） | 催化 | 催化 C-10 立体专一性 β-羟基化，bcbot3Δ 积累 2d (35 mg/L) |
| Botrytis cinerea B05.10 | botrydial 生物合成 | BcBOT4 | BcBOT4（细胞色素P450单加氧酶） | 催化 | 催化 C-4 立体专一性羟基化，bcbot4Δ 积累 2a 并过量产生聚酮 |
| Botrytis cinerea B05.10 | botrydial 生物合成 | BcBOT5 | BcBOT5（乙酰转移酶） | 催化 | 催化 C-4 羟基的乙酰化，生成中间体 2c |
关键发现
- bcbot3Δ 突变体不产 botrydial，积累中间体 4β-acetoxy-15α-hydroxyprobotryane (2d) 达 35 mg/L，并分离到新化合物 4β-hydroxyprobotryan-15-one (9)。bcbot4Δ 突变体不产 botrydial，积累 probotryane (2a)，并大量产生聚酮，已知聚酮包括 botrylatone (21.7 mg)、botcinic acid (6.9 mg)、botcineric acid (4.5 mg)、botcinins A (63.6 mg)、B (37.6 mg)、E (10.1 mg)、G (7.9 mg)、cinbotolide (12 mg)、5-hydroxy-7-(4-hydroxydec-2-enoyl)botrylatone (12.2 mg) 等；新聚酮包括 5-hydroxy-7-(oct-2-enoyl)botrylatone (15
- 5 mg)、6-hydroxy-7-deoxybotrylatone (16, 15 mg)、cinbotolide B (17
- 4 mg)、cinbotolide C (18
- 8 mg)。
研究结论
本研究通过基因敲除和代谢物分析，阐明了灰霉菌 botrydial 生物合成基因簇中五个基因的功能，建立了从法尼基焦磷酸（FPP）到 botrydial 的完整生物合成途径。BcBOT4 和 BcBOT3 分别负责 PSP 骨架 C-4 和 C-10 的立体专一性羟基化，BcBOT1 负责 C-15 羟基化，BcBOT2 催化环化，BcBOT5 催化 C-4 羟基乙酰化。同时发现 BcBOT4 的缺失导致聚酮类化合物过量产生，揭示了该基因在代谢调控中的潜在作用。