Engineering Isoprene Synthase Expression and Activity in Cyanobacteria
- 作者
- Julie E. Chaves, Paloma Rueda-Romero, Henning Kirst, Anastasios Melis
- 单位
- Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, California 94720-3102, United States
- 杂志
- ACS Synthetic Biology（2017）
- DOI
- 10.1021/acssynbio.7b00214
- 所属领域
- 代谢工程; 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
蓝藻中异戊二烯合酶（IspS）表达水平低且催化活性慢，限制了异戊二烯的可再生光合生产。
研究策略
利用蓝藻中高丰度蛋白藻蓝蛋白β亚基（cpcB）作为融合标签，构建不同linker（7、10、16、65个氨基酸）的cpcB-IspS融合蛋白，以提高IspS表达量，并通过linker调节空间构象以改善酶活性。
核心内容
本研究针对蓝藻中异戊二烯合酶（IspS）表达量低且催化活性慢的问题，以聚球藻PCC 6803为底盘，将高丰度藻蓝蛋白β亚基（CpcB）作为融合标签与IspS融合表达，并系统比较了7、10、16、65个氨基酸长度的linker对融合蛋白表达水平和酶活的影响。结果显示，融合表达使IspS表达量提升61至275倍，其中cpcB*L7*IspS菌株异戊二烯产量最高，达28.9 μg/L/h，异戊二烯与生物量比值为5.4 mg/g，较非融合对照提高27倍。尽管该菌株IspS比活力仅为非融合株的约10%，但酶积累量高达254倍，净产量仍大幅提升；体外动力学测定其kcat为0.346 s⁻¹，Km为1.73 mM。直接融合无linker时酶活极低，而linker长度对活性影响不显著，空间折叠方向才是关键决定因素。研究表明，通过高表达策略以酶浓度补偿低催化活性，是提升蓝藻异戊二烯光合生产的有效途径。
创新点
系统比较了不同linker长度和组成的融合蛋白对IspS表达和活力的影响，揭示了酶表达量与比活力之间的权衡关系，并利用RaptorX建模分析linker对蛋白质空间折叠的影响。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP途径（内源异戊二烯前体合成） | IspS | 异戊二烯合酶（IspS） | 催化 | 来自野葛（Pueraria montana），密码子优化，催化DMAPP生成异戊二烯。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | cpc操纵子（藻胆体生物合成） | cpcB | 藻蓝蛋白β亚基（CpcB） | 调控 | 作为高表达融合标签，其强启动子和高丰度蛋白特性提高IspS表达量；融合后藻胆体天线受损，但光合饱和活性不受影响。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 异戊二烯生物合成 | cpcB*IspS | CpcB-IspS直接融合蛋白 | 催化 | 无linker直接融合，表达量最高（275倍），但比活力极低（3.27 μg Isp g^-1 Bms [IspS]^-1），产量5.8 μg/L/h。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 异戊二烯生物合成 | cpcB*L7*IspS | CpcB-L7-IspS融合蛋白 | 催化 | 含7个氨基酸linker（PMPWRVI），产量28.9 μg/L/h，异戊二烯/生物量比5.4 mg/g，比活21.3 μg Isp g^-1 Bms [IspS]^-1。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 异戊二烯生物合成 | cpcB*L10*IspS | CpcB-L10-IspS融合蛋白 | 催化 | 含10个氨基酸linker（PAPAPAPAPA），产量15.3 μg/L/h，比活29.5 μg Isp g^-1 Bms [IspS]^-1。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 异戊二烯生物合成 | cpcB*L16*IspS | CpcB-L16-IspS融合蛋白 | 催化 | 含16个氨基酸刚性α螺旋linker（EAAAK重复），产量10.3 μg/L/h，比活23.9 μg Isp g^-1 Bms [IspS]^-1。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 异戊二烯生物合成 | cpcB*L65*IspS | CpcB-L65-IspS融合蛋白 | 催化 | 含65个氨基酸linker（IspS自身N端60 aa+5 aa transit peptide），产量7.6 μg/L/h，比活4.70 μg Isp g^-1 Bms [IspS]^-1。 |
关键发现
- 融合表达使IspS表达量提高61-275倍
- cpcB*L7*IspS菌株异戊二烯产量最高，达28.9 μg/L/h，异戊二烯/生物量比5.4 mg/g，比非融合对照提高27倍
- 该菌株IspS比活力仅为非融合的约10%，但酶积累量高254倍
- 体外酶动力学显示cpcB*L7*IspS的kcat=0.346 s^-1，Km=1.73 mM
- 直接融合的cpcB*IspS酶活极低，linker长度非关键，空间折叠方向是活性决定因素。
研究结论
通过高表达融合蛋白大幅提高IspS酶浓度可克服其低催化活性，是提高蓝藻异戊二烯产量的有效策略；linker通过改变cpcB与IspS的空间相对方向和距离来调控酶活性。