Off-colony screening of biosynthetic libraries by rapid laser-enabled mass spectrometry
- 作者
- Glen-Oliver F. Gowers, Simon J.S. Cameron, Alvaro Perdones-Montero, David Bell, Soo Mei Chee, Marcelo Kern, David Tew, Tom Ellis, Zoltan Takáts
- 单位
- Imperial College Centre for Synthetic Biology, Imperial College London; Department of Bioengineering, Imperial College London; Section of Computational and Systems Medicine, Department of Surgery and Cancer, Imperial College London; SynbiCITE, Imperial College London; GlaxoSmithKline, Stevenage; Ambimass, London
- 杂志
- ACS Synthetic Biology（2019）
- DOI
- 10.1021/acssynbio.9b00243
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
生物合成文库缺乏快速、无需样品制备的质谱筛选方法，导致菌株工程中代谢产物检测成为瓶颈。
研究策略
采用自动化激光辅助快速蒸发电离质谱(LA-REIMS)，直接从琼脂平板上的酵母菌落中检测代谢物，无需样品制备或提取；结合机器人平台实现自动挑选、实时数据采集及菌落回收。
核心内容
本研究开发了一种基于自动化激光辅助快速蒸发电离质谱（LA-REIMS）的离菌落筛选方法，用于生物合成文库的高通量预筛选。该方法无需样品制备或培养液培养，直接从琼脂平板上的酵母菌落中检测代谢物，并结合机器人平台实现自动取样、实时数据采集和菌落回收，同时可建立甘油库。系统检测速度约为每分钟6个菌落，4小时内可筛选超过450个酵母菌落。在桦木酸产量筛选实验中，成功分离到一株产量提高2.5倍的菌株（1.42 μg ml⁻¹ OD600⁻¹ 对比 0.56 μg ml⁻¹ OD600⁻¹），且LA-REIMS与LCMS定量结果具有显著相关性（R²=0.613，P<0.0001）。在SCRaMbLE筛选实验中，前5%的菌落中鉴定出4株高产菌株，相比随机筛选预期富集至少4倍。研究还证实该方法可检测27种代谢物中的20种，适用面广。结果表明，LA-REIMS作为快速、无需样品制备的预筛选工具，可显著加速菌株工程中的文库筛选，与LCMS等定量方法形成有效互补，尤其适用于大规模文库筛选。
创新点
将LA-REIMS应用于生物合成文库的预筛选；实现每分钟约6个菌落的高通量检测；无需样品制备和培养液培养；同时进行菌落取样和甘油库建立；可检测多种多样生物分子。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (synV strain) | violacein生物合成通路 | vioA | VioA | 催化 | 编码色氨酸-2-单加氧酶，催化violacein生物合成第一步 |
| Saccharomyces cerevisiae (synV strain) | violacein生物合成通路 | vioB | VioB | 催化 | 参与violacein生物合成 |
| Saccharomyces cerevisiae (synV strain) | violacein生物合成通路 | vioC | VioC | 催化 | 参与violacein生物合成 |
| Saccharomyces cerevisiae (synV strain) | violacein生物合成通路 | vioD | VioD | 催化 | 参与violacein生物合成 |
| Saccharomyces cerevisiae (synV strain) | violacein生物合成通路 | vioE | VioE | 催化 | 参与violacein生物合成 |
| Saccharomyces cerevisiae (yGG037, synV with AtATR1) | 桦木酸生物合成通路 | BPLO | BPLO | 催化 | 编码氧化鲨烯环化酶，参与桦木酸生物合成 |
| Saccharomyces cerevisiae (yGG037) | 桦木酸生物合成通路 | AtLUS1 | AtLUS1 | 催化 | 编码羽扇豆醇合酶，参与桦木酸生物合成 |
| Saccharomyces cerevisiae (yGG037) | 甲羟戊酸通路 | tHMG1 | tHMG1 | 催化 | 编码截短的HMG-CoA还原酶，提高甲羟戊酸通路通量 |
| Saccharomyces cerevisiae (yGG037) | 甲羟戊酸通路 | ERG9 | ERG9 | 催化 | 编码角鲨烯合酶，调控甾醇生物合成分支 |
| Saccharomyces cerevisiae (yGG037) | 桦木酸生物合成通路 | AtATR1 | AtATR1 | 催化 | 编码细胞色素P450还原酶，为P450酶提供电子 |
| Saccharomyces cerevisiae (synV strain) | SCRaMbLE系统 | creEBD | Cre-EBD重组酶 | 催化 | 编码雌二醇诱导的Cre重组酶，介导loxP位点重组，实现染色体重排 |
关键发现
- LA-REIMS分析速度约为6个菌落/分钟
- 在4小时内筛选超过450个酵母菌落
- 成功分离到一株桦木酸产量提高2.5倍的菌株（1.42 μg ml-1 OD600-1 vs 0.56 μg ml-1 OD600-1）
- 在27种代谢物中检测到20种
- 桦木酸标准曲线R²=0.967
- LCMS与LA-REIMS相关性R²=0.613（P<0.0001）
- 在SCRaMbLE筛选实验中，前5%的菌落中鉴定出4株高产菌株，相比随机筛选的预期（约1%）富集至少4倍。
研究结论
LA-REIMS是一种快速、无需样品制备的预筛选工具，可显著加速菌株工程中的文库筛选，与LCMS等定量方法互补，特别适用于大文库和大规模筛选。