Exploration and Mining of the Bacterial Terpenome
- 作者
- David E. Cane, Haruo Ikeda
- 单位
- Department of Chemistry, Box H, Brown University, Providence, Rhode Island 02912-9108, United States; Laboratory of Microbial Engineering, Kitasato Institute for Life Sciences, Kitasato University, 1-15-1 Kitasato, Sagamihara, Minami-ku, Kanagawa 252-0373, Japan
- 杂志
- Accounts of Chemical Research（2012）
- DOI
- 10.1021/ar200198d
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
细菌萜类化合物种类繁多但传统筛选方法发现的极少，缺乏系统挖掘细菌基因组中萜烯合酶及其生物合成途径的方法。
研究策略
利用profile HMM和BLAST等生物信息学工具从细菌基因组中筛选候选萜烯合酶基因，并通过体外重组蛋白与底物孵育、体内工程化宿主（E. coli和S. avermitilis SUKA菌株）异源表达来验证功能，进而解析完整生物合成途径。
核心内容
该研究系统挖掘了细菌基因组中的萜类生物合成资源，针对传统方法难以发现细菌萜烯合酶的问题，采用profile HMM与BLAST等生物信息学工具，对近两百万个预测蛋白质进行筛选，获得41个候选萜烯合酶基因，并借助体外重组蛋白孵育及工程化大肠杆菌和基因组精简的Streptomyces avermitilis SUKA菌株进行异源表达验证。研究发现超过120个细菌萜烯合酶基因，并鉴定出多种新型酶：SCO6073为双功能酶，催化FPP生成85:15的germacradienol与germacrene D混合物，同时参与geosmin合成；SAV76催化FPP生成以avermitilol为主（85%）的多种倍半萜。此外还阐明了2-甲基异冰片合酶、epi-isozizaene合酶（晶体结构分辨率达1.60 Å）及P450酶介导的氧化重排等新催化机制。该工作将基因组挖掘与生化表征及结构生物学结合，大幅拓展了细菌萜类化合物多样性认知，为萜烯合酶结构与功能关系研究及萜类天然产物的工程化生产奠定了重要基础。
创新点
建立了基于profile HMM的细菌萜烯合酶系统挖掘方法；发现多种新型萜烯合酶及环化机制；阐明双功能geosmin合酶和2-甲基异冰片合酶的生物合成途径；发现一系列新型P450和非血红素铁依赖氧化酶催化新反应（如两步酮化、去饱和-环氧化、Baeyer-Villiger氧化）；开发了基因组精简的S. avermitilis SUKA宿主用于异源表达。
研究对象（21）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces coelicolor A3(2) | 倍半萜生物合成 (FPP→germacradienol/geosmin) | sco6073 | Germacradienol/geosmin synthase (SCO6073) | 催化 | 双功能酶；N端催化FPP环化生成germacradienol和germacrene D（85:15），C端催化germacradienol转化为geosmin |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | 2-甲基异冰片生物合成 | sco7701 | 2-甲基橙花基二磷酸合酶 (SCO7701) | 催化 | C-甲基转移酶，催化GPP与SAM生成(E)-2-甲基橙花基二磷酸(2-MeGPP) |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | 2-甲基异冰片生物合成 | sco7700 | 2-甲基异冰片合酶 (SCO7700) | 催化 | 催化2-MeGPP环化生成2-甲基异冰片 |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | epi-isozizaene/albaflavenone生物合成 | sco5222 | Epi-isozizaene synthase (SCO5222) | 催化 | 催化FPP环化生成(+)-epi-isozizaene；晶体结构1.60 Å |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | epi-isozizaene/albaflavenone生物合成 | sco5223 | CYP170A1 (SCO5223) | 催化 | 细胞色素P450，连续氧化epi-isozizaene的烯丙位生成albaflavenone（经albaflavenol中间体） |
| Streptomyces avermitilis MA-4680 | geosmin生物合成 | sav2163 | Geosmin synthase (GeoA) | 催化 | 与SCO6073同源，催化FPP生成germacradienol和geosmin |
| Streptomyces avermitilis MA-4680 | epi-isozizaene/albaflavenone生物合成 | sav3032 | Epi-isozizaene synthase (SAV3032) | 催化 | 催化FPP生成epi-isozizaene，与下游sav3031转录偶联 |
| Streptomyces avermitilis MA-4680 | epi-isozizaene/albaflavenone生物合成 | sav3031 | CYP170A2 (SAV3031) | 催化 | 细胞色素P450，氧化epi-isozizaene生成albaflavenol和albaflavenone，以及新环氧醇19 |
| Streptomyces avermitilis MA-4680 | avermitilol生物合成 | sav76 | Avermitilol synthase (SAV76) | 催化 | 催化FPP生成avermitilol (85%)、viridiflorol (3%)、germacrene A (1%)、germacrene B (5%) |
| Streptomyces avermitilis MA-4680 | pentalenolactone/neopentalenolactone生物合成 | sav2998 | Pentalenene synthase (PtIA) | 催化 | 催化FPP环化生成pentalenene |
| Streptomyces avermitilis MA-4680 | pentalenolactone/neopentalenolactone生物合成 | sav2999 | PtII (CYP450) | 催化 | 细胞色素P450，三步氧化pentalenene生成pentalenal和1-脱氧pentalenic acid |
| Streptomyces avermitilis MA-4680 | pentalenolactone/neopentalenolactone生物合成 | sav2991 | PtIH (非血红素铁双加氧酶) | 催化 | 催化1-脱氧pentalenic acid的11β-羟基化 |
| Streptomyces avermitilis MA-4680 | pentalenolactone/neopentalenolactone生物合成 | sav2993 | PtIF (NAD+依赖脱氢酶) | 催化 | 催化25氧化为环戊酮26 |
| Streptomyces avermitilis MA-4680 | pentalenolactone/neopentalenolactone生物合成 | sav2994 | PtIE (黄素依赖Baeyer-Villiger单加氧酶) | 催化 | 催化26氧化得到neopentalenolactone D (27)，而非pentalenolactone D |
| Streptomyces avermitilis MA-4680 | pentalenolactone/neopentalenolactone生物合成 | sav2995 | PtID (α-酮戊二酸非血红素铁双加氧酶) | 催化 | 催化neopentalenolactone D去饱和生成neopentalenolactone E |
| Streptomyces exfoliatus UC5319 | pentalenolactone生物合成 | penE | PenE (Baeyer-Villiger单加氧酶) | 催化 | 催化26氧化专一生成pentalenolactone D |
| Streptomyces exfoliatus UC5319 | pentalenolactone生物合成 | penD | PenD (非血红素铁双加氧酶) | 催化 | 催化28去饱和/环氧化生成pentalenolactone E和F |
| Streptomyces exfoliatus UC5319 | pentalenolactone生物合成 | penM | PenM (细胞色素P450) | 催化 | 催化pentalenolactone F氧化重排为pentalenolactone |
| Streptomyces arenae TU469 | pentalenolactone生物合成 | pntE | PntE (Baeyer-Villiger单加氧酶) | 催化 | 同PenE功能 |
| Streptomyces arenae TU469 | pentalenolactone生物合成 | pntD | PntD (非血红素铁双加氧酶) | 催化 | 同PenD功能 |
| Streptomyces arenae TU469 | pentalenolactone生物合成 | pntM | PntM (细胞色素P450) | 催化 | 同PenM功能 |
关键发现
- 从1,922,990个预测蛋白质中筛选出41个候选萜烯合酶，分为3组（12、27、2）
- 共确认超过120个细菌萜烯合酶基因。SCO6073催化FPP生成85:15的germacradienol和germacrene D混合物，并证明为双功能酶同时催化geosmin形成。SCO7700与SCO7701在体外重建生成2-甲基异冰片。SAV76催化FPP生成avermitilol（85%）、viridiflorol（3%）、germacrene A（1%）和germacrene B（5%）。SUKA菌株删除了约1 Mb DNA。S. avermitilis ptl基因簇长13.4 kb，编码13个CDS，其产物PtIE和PtID分别催化合成neopentalenolactone D和E。epi-isozizaene合酶晶体结构分辨率1.60 Å。P450酶PenM/PntM催化pentalenolactone F氧化重排为pentalenolactone。
研究结论
基因组挖掘与生化表征、结构生物学、遗传学相结合，在细菌中发现了大量新的萜烯合酶、萜类化合物及新环化机制，为理解萜烯合酶结构与功能关系以及萜类天然产物的工程化生产奠定了基础。