Heterologous Leader Sequences in Fusion Constructs Enhance Expression of Geranyl Diphosphate Synthase and Yield of β-Phellandrene Production in Cyanobacteria (Synechocystis)
- 作者
- Nico Betterle, Anastasios Melis
- 单位
- 加州大学伯克利分校植物与微生物生物学系
- 杂志
- ACS Synthetic Biology（2018）
- DOI
- 10.1021/acssynbio.7b00431
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
蓝藻中异源萜烯合成酶（如GPPS）表达水平低，导致β-水芹烯前体GPP供应不足，限制其产量。需要提高GPPS表达来增加代谢通量。
研究策略
利用融合构建体策略，将高表达基因（内源cpcB、异源nptI和cmR）的leader序列与GPPS基因融合，在强启动子P_TRC控制下表达，以提高GPPS蛋白积累，从而增强β-水芹烯合成。
核心内容
该研究针对蓝藻中异源萜烯合成酶表达水平低、导致β-水芹烯前体供应不足的问题，在集胞藻PCC 6803中采用融合构建体策略，将内源cpcB及异源nptI、cmR高表达基因的leader序列与香叶基焦磷酸合酶（GPPS）融合，置于强启动子P_TRC下表达。结果显示，NptI*GPPS融合使GPPS蛋白积累提高约60倍，β-水芹烯产量达5.95 mg/g dcw，较对照的1.42 mg/g dcw提升约4.2倍；CmR29*GPPS和GPPS-SmR产量分别为2.42和1.89 mg/g dcw。nptI融合兼具选择标记功能，87个核苷酸的短片段CmR29 leader同样有效且可避免内部重组。所有转化子生长速率约为野生型的55%。研究表明异源高表达基因leader序列可有效驱动蓝藻中难表达的植物源萜烯合成酶积累，但60倍的酶水平提升仅带来4倍产量增长，提示底物通量和前体平衡仍是限制单萜合成的关键因素。
创新点
1. 证明异源高表达基因（nptI和cmR）可作为leader序列驱动GPPS过表达；2. nptI作为leader时兼具选择标记功能；3. 短片段leader（CmR29，87个核苷酸）也能有效提高表达，且可避免内部重组。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP途径 | cpcB | CpcB（藻蓝蛋白β亚基） | 调控 | 内源高表达基因，作为leader序列与β-水芹烯合酶（PHLS）融合形成CpcB*PHLS融合蛋白，用于过表达PHLS。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 单萜生物合成（β-水芹烯合成） | PHLS | β-水芹烯合酶（β-PHLS） | 催化 | 来自薰衣草，催化GPP生成β-水芹烯。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 单萜生物合成（GPP合成） | GPPS2 | 香叶基焦磷酸合酶（GPPS2） | 催化 | 来自欧洲云杉（Picea abies），催化DMAPP和IPP缩合生成GPP。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 抗生素抗性 | nptI | 新霉素磷酸转移酶（NPTI） | 调控 | 作为leader序列与GPPS融合形成NptI*GPPS，同时提供卡那霉素抗性作为选择标记。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 抗生素抗性 | cmR（部分序列如CmR29） | 氯霉素乙酰转移酶（CmR） | 调控 | 截短的cmR序列（如87核苷酸的CmR29）作为leader增强GPPS表达，避免全长序列引起的内部重组。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP途径 | slr0611 | 推测的香叶基焦磷酸合酶样蛋白（prenyltransferase） | 催化 | 内源可能的GPPS同源蛋白，约32 kDa，与GPPS2抗体有交叉反应。 |
关键发现
NptI*GPPS融合表达使GPPS蛋白水平提高约60倍（相对单位60±15，对照为1.0），β-水芹烯产量达5.95 mg/g dcw，而对照（仅CpcB*PHLS）为1.42 mg/g dcw，提高约4.2倍。CmR29*GPPS产量为2.42 mg/g dcw，GPPS-SmR为1.89 mg/g dcw。所有转化子的生长速率约为野生型（2.10±0.26 day-1）的55%，如R+NptI*GPPS生长速率为0.81±0.16 day-1。
研究结论
异源高表达基因（如nptI和cmR）作为leader序列可有效提高难表达的植物源萜烯合成酶（如GPPS）在蓝藻中的积累，从而提升β-水芹烯产量。nptI融合兼具选择标记功能，短片段CmR29 leader可避免内部重组。但GPPS表达增加60倍仅带来产量4倍增加，表明还有其他限制因素如底物通量和前体平衡。