Biosynthesis of Cyclic Diterpenes in Extracts from Seedlings of Ricinus communis L. II. Conversion of Geranylgeranyl Pyrophosphate into Diterpene Hydrocarbons and Partial Purification of the Cyclization Enzymes
- 作者
- David R. Robinson, Charles A. West
- 杂志
- Biochemistry（1970）
- DOI
- 10.1021/bi00803a011
- 所属领域
- 植物生物化学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
研究蓖麻（Ricinus communis L.）幼苗无细胞提取物中环状二萜的生物合成，明确牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）如何转化为多种二萜烃类，并对参与环化反应的酶进行纯化和性质研究。
研究策略
通过制备蓖麻幼苗无细胞提取物，以14C标记的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸为底物进行酶促反应，结合薄层色谱分离产物；利用高速离心、硫酸铵分级沉淀、CM-葡聚糖凝胶和DEAE-纤维素柱层析对环化酶进行部分纯化；分析pH、金属离子、巯基试剂及植物生长延缓剂对酶活性的影响。
核心内容
该研究以蓖麻幼苗无细胞提取物为材料，以14C标记的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）为底物，证实其可转化为五种环状二萜烃：(+)-beyerene、(+)-sandaracopimaradiene、(-)-kaurene、trachylobane和casbene。通过高速离心、硫酸铵沉淀及CM-葡聚糖凝胶和DEAE-纤维素柱层析，环化酶总活性被纯化约10倍，比活从1.9单位/mg蛋白提高到18.6单位/mg蛋白。环化反应最适pH为7.0–7.2，依赖Mg²⁺（2×10⁻³ M）或Mn²⁺（2×10⁻⁴ M），推测酶分子量约200,000。植物生长延缓剂实验显示，0.3 mM Amo 1618和Phosfon几乎完全抑制beyerene、sandaracopimaradiene、kaurene和trachylobane的生成，但仅Phosfon显著抑制casbene合成；巯基抑制剂N-乙基马来酰亚胺（1 mM）和p-氯汞苯甲酸（1 mM）也能完全抑制各环化活性。各产物对应的环化酶活性可部分分离，但kaurene和trachylobane的活性始终无法分开。研究首次证明GGPP是这些环状二萜的共同前体，且casbene合成不依赖柯巴基焦磷酸中间体，与C族二萜途径不同；结果支持GGPP作为二萜通用前体的观点，并提示植物生长延缓剂的作用机制涉及对多种环化酶的抑制。
创新点
首次证明GGPP是五种环状二萜烃（(+)-beyerene、(+)-sandaracopimaradiene、(-)-kaurene、trachylobane和casbene）共同的前体；部分分离了生成不同二萜的环化酶活性，揭示各产物可能由独立酶催化（kaurene和trachylobane活性未能分开）；提出了从GGPP经柯巴基焦磷酸中间体到C族二萜的分路生物合成途径。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ricinus communis L. seedlings | 二萜生物合成 | — | beyerene-forming cyclase | 催化 | 催化GGPP环化生成(+)-beyerene |
| Ricinus communis L. seedlings | 二萜生物合成 | — | sandaracopimaradiene-forming cyclase | 催化 | 催化GGPP环化生成(+)-sandaracopimaradiene |
| Ricinus communis L. seedlings | 二萜生物合成 | — | kaurene-forming cyclase | 催化 | 催化GGPP经柯巴基焦磷酸生成(-)-kaurene |
| Ricinus communis L. seedlings | 二萜生物合成 | — | trachylobane-forming cyclase | 催化 | 催化GGPP经柯巴基焦磷酸生成trachylobane，与kaurene合成活性未分离 |
| Ricinus communis L. seedlings | 二萜生物合成 | — | casbene-forming cyclase | 催化 | 催化GGPP直接环化生成casbene，不含柯巴基焦磷酸中间体 |
关键发现
- 蓖麻幼苗无细胞提取物可将GGPP转化为casbene、(+)-beyerene、(+)-sandaracopimaradiene、(-)-kaurene和trachylobane。环化反应最适pH为7.0-7.2，纯化后依赖Mg2+（2×10^-3 M）或Mn2+（2×10^-4 M）。凝胶过滤显示酶分子量约200,000。
- 3 mM Amo 1618和Phosfon几乎完全抑制beyerene、sandaracopimaradiene、kaurene和trachylobane的生成，0.6 mM CCC部分抑制，但仅Phosfon显著抑制casbene生成。经CM-葡聚糖凝胶和DEAE-纤维素层析后，总酶活纯化约10倍，比活从1.9单位/mg蛋白提高至18.6单位/mg蛋白。巯基抑制剂N-乙基马来酰亚胺在1 mM时显著抑制各环化活性，10 mM时几乎完全抑制；p-氯汞苯甲酸1 mM也完全抑制。25°C发芽的幼苗提取物中casbene合成几乎消失。
- 5-3天龄30°C发芽的幼苗提取物环化活性最高。
研究结论
蓖麻幼苗中环状二萜从GGPP的生成由多个特异的环化酶催化，其中kaurene和trachylobane的合成酶活性无法分离，可能共享同一酶复合物；casbene合成途径与C族二萜不同，其环化酶不依赖柯巴基焦磷酸中间体。该研究支持GGPP是环状二萜通用前体的观点，并表明植物生长延缓剂的作用机制可能涉及对多种环化酶的抑制。