A Gene Cluster for Biosynthesis of the Sesquiterpenoid Antibiotic Pentalenolactone in Streptomyces avermitilis†
- 作者
- Charles N. Tetzlaff, Zheng You, David E. Cane, Satoshi Takamatsu, Satoshi Omura, Haruo Ikeda
- 单位
- Department of Chemistry, Brown University, Box H, Providence, Rhode Island 02912-9108; Kitasato Institute for Life Sciences, Kitasato University, 1-151-1, Kitasato, Sagamihara, Kanagawa 228-8555, Japan; The Kitasato Institute, 9-1, Shirokane 5-chome, Minato-ku, Tokyo 108-8642, Japan
- 杂志
- Biochemistry（2006）
- DOI
- 10.1021/bi060419n
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）中倍半萜抗生素pentalenolactone生物合成基因簇的组成与功能，并验证关键基因（ptlA和gap1）的生化功能。
研究策略
利用基因组序列分析识别候选基因簇，通过基因敲除、异源表达、大肠杆菌表达纯化、酶动力学分析和GAPDH抑制实验，对基因簇进行功能验证。
核心内容
该研究解析了阿维链霉菌中倍半萜抗生素pentalenolactone生物合成基因簇的组成与功能。通过基因组序列分析鉴定出一个13.4 kb的ptl基因簇，包含13个开放阅读框，并通过基因敲除、异源表达及生化实验验证了关键基因的功能。基因簇删除后产物消失，将其转入变铅青链霉菌1326后产生约1 mg/L的支路代谢物pentalenic acid，同时从原菌中分离到中间产物pentalenolactone F（8 mg甲基酯）。大肠杆菌中异源表达的PtlA可催化法尼基焦磷酸环化为pentalenene，其kcat为0.065 s⁻¹，Km为36 μM，证实ptlA编码pentalenene合酶。研究还阐明了自身抗性机制：gap1编码对pentalenolactone不敏感的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），在0.6 mM抑制剂处理8分钟后活性不变；而gap2编码的敏感型GAPDH则被不可逆抑制（kinact=5.3±1.6 min⁻¹，KI=1.3±0.4 mM），推测gap1负责初级代谢保障，gap2参与正常糖酵解。该发现首次证实阿维链霉菌含有完整的pentalenolactone生物合成途径，为后续通过氧化还原酶基因（如P450、单加氧酶）解析后续氧化修饰步骤奠定了基础。
创新点
首次报道S. avermitilis中存在功能性的pentalenolactone生物合成基因簇；证明ptlA编码pentalenene合酶；阐明gap1为自身抗性基因，且gap2为敏感型GAPDH同工酶。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces avermitilis | pentalenolactone生物合成 | ptlA (SAV2998) | Pentalenene合酶 | 催化 | 催化FPP环化生成pentalenene；在大肠杆菌中表达并验证活性 |
| Streptomyces avermitilis | pentalenolactone生物合成/自抗性 | gap1 (SAV2990) | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（pentalenolactone不敏感型） | 催化 | 对pentalenolactone不敏感，构成自身抗性机制 |
| Streptomyces avermitilis | 糖酵解 | gap2 (SAV6296) | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（pentalenolactone敏感型） | 催化 | 组成型表达，被pentalenolactone不可逆抑制 |
| Escherichia coli | pentalenolactone生物合成（异源表达） | ptlA | PtlA | 催化 | 在E. coli BL21(DE3)中表达，用于酶活性表征 |
| Streptomyces lividans 1326 | pentalenolactone生物合成 | ptlA等基因簇 | Pentalenene合酶等 | 催化 | 异源表达完整基因簇，产生约1 mg/L pentalenic acid |
| Streptomyces avermitilis | pentalenolactone生物合成 | ptlB (SAV2997) | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 推测提供FPP前体 |
| Streptomyces avermitilis | pentalenolactone生物合成 | ptlI (SAV2999) | CYP183A1（细胞色素P450） | 催化 | 推测催化pentalenene氧化为1-脱氧pentalenic acid |
| Streptomyces avermitilis | pentalenolactone生物合成 | ptlG (SAV2992) | 跨膜外排蛋白 | 转运 | 属于MFS家族，可能负责产物外排 |
| Streptomyces avermitilis | pentalenolactone生物合成 | ptlR (SAV3000) | AraC家族转录调控因子 | 调控 | 推测调控基因簇表达 |
关键发现
- 在S. avermitilis中发现13.4 kb的ptl基因簇，包含13个ORF，从中分离到中间产物pentalenolactone F（8 mg甲基酯）及支路代谢物pentalenic acid
- 基因簇删除后产物消失，转入S. lividans 1326后产生约1 mg/L pentalenic acid。PtlA在大肠杆菌中表达后催化FPP环化为pentalenene，kcat=0.065 s^-1，Km=36 μM，kcat/Km=1.8×10^3 M^-1 s^-1（His标签UC5319合酶：kcat=0.40 s^-1，Km=28.6 μM
- 天然UC5319合酶：kcat=0.3 s^-1，Km=0.3 μM）。Gap1对pentalenolactone不敏感，在0.6 mM PLBA处理8 min后活性不变，其kcat=33 s^-1，Km=0.33 mM
- Gap2被pentalenolactone不可逆抑制，kcat=165 s^-1，Km=0.33 mM，kinact=5.3±1.6 min^-1，KI=1.3±0.4 mM。
研究结论
S. avermitilis含有完整的pentalenolactone生物合成基因簇，ptlA编码pentalenene合酶，gap1赋予自身抗性，gap2为敏感型GAPDH，参与正常代谢。该基因簇的氧化还原酶基因（如P450、单加氧酶等）可能催化后续的氧化修饰步骤。