Isopentenyldiphosphate:Dimethylallyldiphosphate Isomerase: Construction of a High-Level Heterologous Expression System for the Gene from Saccharomyces cerevisiae and Identification of an Active-Site Nucleophile
- 作者
- Ian P. Street, C. Dale Poulter
- 单位
- Department of Chemistry, University of Utah, Salt Lake City, Utah 84112
- 杂志
- Biochemistry（1990）
- DOI
- 10.1021/bi00484a023
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
构建酿酒酵母IPP异构酶的高效异源表达系统以获得足量酶蛋白，并鉴定其活性位点亲核试剂。
研究策略
将酿酒酵母IPP异构酶基因编码区克隆到含rec 7启动子的原核表达载体pARC306N中，在大肠杆菌JM101中过表达；利用FIPP不可逆抑制剂标记酶，结合蛋白酶解、HPLC分离和Edman降解鉴定共价修饰位点。
核心内容
该研究构建了酿酒酵母异戊烯基焦磷酸异构酶（IPP异构酶）在大肠杆菌中的高效异源表达系统，并利用不可逆抑制剂FIPP鉴定了该酶的活性位点亲核残基。作者将酵母IPP异构酶基因编码区克隆至含rec 7启动子的pARC306N载体，转化大肠杆菌JM101后，重组酶蛋白占可溶蛋白的30–35%，比活较未转化宿主提高超过100000倍；经两步纯化后纯度大于95%，比活达20 units/mg，约为酵母天然酶的7.5倍，Km值为43 μM。通过FIPP共价标记结合蛋白酶解、HPLC分离及Edman降序测序，鉴定出主要修饰位点为Cys-139，占放射性标记的76%，次要位点为Cys-138（4%）；酶与FIPP结合化学计量为0.79 mol/mol，DTNB测定每单体含6.8个游离巯基，表明Cys-139不参与二硫键。该结果首次证明酵母IPP异构酶活性位点的亲核基团为Cys-139，且重组酶与天然酶性质一致，为异戊二烯代谢途径的酶学机制研究和后续工程改造提供了高效表达平台及关键催化残基信息。
创新点
首次实现IPP异构酶在大肠杆菌中的超高水平表达（占可溶蛋白30-35%），建立两步纯化法；通过FIPP共价标记首次鉴定酵母IPP异构酶活性位点亲核体为Cys-139。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM101 | 异戊二烯生物合成途径 | Saccharomyces cerevisiae IPP isomerase gene | Isopentenyl diphosphate isomerase (IPP isomerase) | 催化 | 重组表达，催化IPP与DMAPP相互转化，过表达量占可溶蛋白30-35% |
关键发现
- 重组菌JM101/pIPS241中IPP异构酶比活较未转化宿主提高超过100000倍
- 过表达酶占可溶蛋白的30-35%，两步纯化后纯度大于95%，比活为20 units/mg，较酵母来源酶高7.5倍
- Km为43 μM
- FIPP灭活动力学常数k2=1.0±0.02 min⁻¹，KI=3.8±1.6 μM
- 酶与FIPP结合化学计量为0.79±0.08 mol/mol
- DTNB测定每单体含6.8±0.4个游离巯基
- 放射性标记肽段测序显示主要修饰位点为Cys-139（占76%放射性），次要位点Cys-138占4%。
研究结论
成功建立酵母IPP异构酶在大肠杆菌中的高效异源表达系统，重组酶与天然酵母酶性质一致；FIPP特异性地共价修饰Cys-139，该残基位于活性位点且不参与二硫键，是催化机制中的关键亲核基团。