Chimeragenesis of the Fatty Acid Binding Site of Cytochrome P450BM3. Replacement of Residues 73-84 with the Homologous Residues from the Insect Cytochrome P450 CYP4C7
- 作者
- Marat B. Murataleiv, Long N. Trinh, Lani V. Moser, Robert B. Bates, René Feyereisen, F. Ann Walker
- 单位
- Department of Chemistry, University of Arizona, Tucson, Arizona 85721-0041; INRA Centre de Recherches d'Antibes, 1382 Route de Biot, 06560 Valbonne, France
- 杂志
- Biochemistry（2004）
- DOI
- 10.1021/bi035674b
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
P450BM3对脂肪酸的底物特异性和区域选择性较窄，限制了其在生物技术中的应用，需要基因工程改造以拓宽底物谱和改变氧化区域选择性。
研究策略
基于P450BM3与棕榈油酸复合物晶体结构，将参与底物结合的73-84位氨基酸片段替换为昆虫CYP4C7的同源片段，设计并构建四种嵌合蛋白（C(73-84)、C(73-78)、C(75-80)、C(78-82)），通过表达纯化、光谱分析、活性测定和产物鉴定系统表征其功能。
核心内容
研究者以P450BM3与棕榈油酸复合物晶体结构为依据，将其底物结合位点73–84位氨基酸片段替换为昆虫CYP4C7的同源序列，构建了四种嵌合酶C(73-84)、C(73-78)、C(75-80)和C(78-82)，以考察片段长度和位置对底物偏好与区域选择性的影响。光谱和活性测定显示，C(78-82)对棕榈酸羟化活性保持约80%，而11-和12-羟基棕榈酸生成速率提高至106和212 min⁻¹，较野生型增加7倍，并新产生10-羟基棕榈酸。C(73-84)和C(73-78)虽使棕榈酸羟化活性下降3–4个数量级，却将法尼醇氧化主要引向新产物5-羟基法尼醇，其中C(73-78)以该产物为主。结果表明，扫描嵌合诱变可通过替换底物结合位点片段有效移动单加氧反应的氧化位点，生成野生型酶无法产生的新化合物，为P450BM3底物谱拓展和新型生物催化剂开发提供了可行策略。
创新点
['首次应用扫描嵌合诱变方法系统研究P450BM3底物结合位点片段的结构-功能关系', '获得能合成新产物5-羟基法尼醇和10-羟基棕榈酸的嵌合酶，这些产物野生型P450BM3不产生', '证明通过替换底物结合位点片段可将单加氧反应的区域选择性向底物分子中心移动']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus megaterium | 脂肪酸羟化 | P450BM3 | P450BM3 | 催化 | 野生型可溶性脂肪酸羟化酶，含血红素、FAD和FMN辅因子，催化棕榈酸C13-C15位羟化 |
| 昆虫（未指明具体种） | 萜类羟化 | CYP4C7 | CYP4C7 | 催化 | 法尼醇区域和立体特异性羟化酶，生成(10E)-12-羟基法尼醇，提供同源替换片段 |
| Bacillus megaterium | 脂肪酸羟化/萜类羟化 | P450BM3嵌合体C(73-84) | 嵌合蛋白C(73-84) | 催化 | 以CYP4C7的97-108位替换P450BM3的73-84位；棕榈酸羟化活性0.24 min-1，法尼醇氧化26 min-1；产生5-羟基法尼醇和10/11/12-羟基棕榈酸 |
| Bacillus megaterium | 脂肪酸羟化/萜类羟化 | P450BM3嵌合体C(73-78) | 嵌合蛋白C(73-78) | 催化 | 替换73-78位；棕榈酸羟化1.7 min-1，法尼醇氧化29 min-1；5-羟基法尼醇为主要产物 |
| Bacillus megaterium | 脂肪酸羟化/萜类羟化 | P450BM3嵌合体C(75-80) | 嵌合蛋白C(75-80) | 催化 | 替换75-80位；棕榈酸羟化190 min-1，法尼醇氧化5.3 min-1；产生5-羟基法尼醇，催化六种位置羟基化 |
| Bacillus megaterium | 脂肪酸羟化/萜类羟化 | P450BM3嵌合体C(78-82) | 嵌合蛋白C(78-82) | 催化 | 替换78-82位；活性最接近野生型，棕榈酸羟化2643 min-1，法尼醇氧化360 min-1；11-和12-羟基棕榈酸速率增加7倍，10-羟基棕榈酸从0增至106 min-1 |
关键发现
- 野生型P450BM3棕榈酸羟化活性为3240±420 min-1，法尼醇氧化为344±56 min-1。C(78-82)棕榈酸羟化活性为2643±340 min-1（约抑制20%），法尼醇氧化为360±5 min-1（无抑制）
- C(73-84)棕榈酸羟化活性仅0.24±0.06 min-1（抑制4个数量级），法尼醇氧化为26±2 min-1（抑制13倍）
- C(73-78)棕榈酸羟化活性1.7±0.3 min-1（抑制3个数量级），法尼醇氧化29±3 min-1（抑制12倍）
- C(75-80)棕榈酸羟化190±15 min-1（抑制17倍），法尼醇氧化5.3±0.5 min-1（抑制65倍）。C(78-82)的11-和12-羟基棕榈酸形成速率较野生型增加7倍，分别达106 min-1和212 min-1，10-羟基棕榈酸从0增至106 min-1。嵌合酶C(73-84)、C(73-78)、C(75-80)产生新产物5-羟基法尼醇，其中C(73-78)以5-羟基法尼醇为主要产物。表达水平：C(73-84)、C(73-78)、C(75-80)为250-300 nmol/L培养，C(78-82)为50-70 nmol/L培养。
研究结论
扫描嵌合诱变成功改变了P450BM3的底物结合和催化区域选择性，使氧化位点向底物分子中心移动，生成了野生型酶不能产生的新化合物（10-羟基棕榈酸和5-羟基法尼醇），表明该方法可用于P450BM3的底物特异性改造和新型生物催化剂的开发。