Conformational Change and Ligand Binding in the Aristolochene Synthase Catalytic Cycle
- 作者
- Marc W. van der Kamp, Jitnapa Sirirak, Jolanta Żurek, Rudolf K. Allemann, Adrian J. Mulholland
- 单位
- Centre for Computational Chemistry, School of Chemistry, University of Bristol; School of Chemistry and Cardiff Catalysis Institute, Cardiff University
- 杂志
- Biochemistry（2013）
- DOI
- 10.1021/bi400898k
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析倍半萜合酶 aristolochene synthase 催化循环中底物法尼基二磷酸（FDP）和镁离子的结合顺序、构象变化的驱动力以及反应活性 Michaelis 复合物的结构。
研究策略
对多种酶-配体复合物（apo、FDP/PPi 与不同镁离子组合）进行总计超过 2 μs 的分子动力学模拟，结合晶体结构比对和构象分析，验证配体结合序列并寻找活性构象。
核心内容
该研究通过累计超过2微秒的分子动力学模拟，系统解析了来自曲霉的aristolochene合酶催化循环中底物法尼基二磷酸和镁离子的结合顺序及构象变化机制。模拟结果支持配体依次按FDP、Mg²⁺B、Mg²⁺C、Mg²⁺A的顺序结合，并揭示只有当二磷酸基团与Mg²⁺B、Mg²⁺C同时存在时酶才稳定处于闭合活性构象。研究首次获得了包含三个镁离子和硫代底物类似物的Michaelis复合物模型，其中C1-C10距离最小为4.07 Å，Glu94与镁离子的相互作用可将该距离缩短至平均4.44 Å。结合突变实验数据，Glu94对应的Glu→Asp和Glu→Gln突变分别使kcat降低4.4倍和9倍，Tyr92→Ala突变导致约80%线性法尼烯产物，证实了这些残基对环化反应的关键作用。该工作为萜类合酶的理性工程改造提供了原子水平的结构基础。
创新点
首次通过分子动力学模拟获得了具有三个镁离子和 FDP 结合的硫代底物类似物 Michaelis 复合物模型；揭示 FDP 先结合、随后依次结合 Mg²⁺B、Mg²⁺C 和 Mg²⁺A 的动态过程；提出了构象开放-闭合转换由 Mg²⁺B 和 Mg²⁺C 同时存在所维持的机制。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus terreus | 倍半萜生物合成 | — | aristolochene synthase (AT-AS) | 催化 | 主要研究对象，催化 FDP 环化生成 aristolochene，采用闭合晶体结构 2OA6 链 D 进行模拟 |
| Penicillium roqueforti | 倍半萜生物合成 | — | aristolochene synthase (PR-AS) | 催化 | 与 AT-AS 序列 61% 一致、85% 相似，用于突变文献对比和功能对应关系 |
关键发现
- 模拟总时长达
- 35 μs；支持 Shishova 等人提出的配体结合顺序：FDP 结合→Mg²⁺B→Mg²⁺C→Mg²⁺A；只有同时存在二磷酸基团、Mg²⁺B 和 Mg²⁺C 时酶才稳定处于闭合构象；获得的可能 Michaelis 复合物中 C1-C10 距离最小为
- 07 Å；Glu94 与 Mg²⁺A/Mg²⁺C 的相互作用可缩短 C1-C10 距离（平均
- 44 Å）；文献中 PR-AS 的 Glu119 突变（对应 AT-AS Glu94）导致 kcat 降低
- 4 倍（Glu→Asp）或 9 倍（Glu→Gln），Tyr92→Ala 突变导致约 80% 线性法尼烯产物。
研究结论
分子动力学模拟证实并细化了 aristolochene synthase 的配体结合和构象变化循环：FDP 首先结合，随后依次结合 Mg²⁺B、Mg²⁺C，最后 Mg²⁺A；闭合构象需要 Mg²⁺B/Mg²⁺C 与二磷酸基团同时存在；模拟获得了与实验证据一致的潜在 Michaelis 复合物模型，为萜类合酶的理性工程改造提供了结构基础。