高级醇 · 代谢工程文献库

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Structure—Function Mapping of Key Determinants for Hydrocarbon Biosynthesis by Squalene and Squalene Synthase-like Enzymes from the Green Alga Botryococcus braunii Race B

作者
Stephen A. Bell, Thomas D. Niehaus, S. Eric Nybo, Joseph Chappell
单位
Plant and Soil Sciences, University of Kentucky, Lexington, Kentucky 40546-0312, United States; Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky, Lexington, Kentucky 40536-0596, United States
杂志
Biochemistry
DOI
10.1021/bi501264s
所属领域
代谢工程 / 合成生物学
关键词
Botryococcus brauniibotryococcene synthasesite-directed mutagenesissqualene synthasestructure-functiontriterpene biosynthesis
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解决的核心问题

确定控制角鲨烯合酶和类似酶（SSL-1、SSL-3）催化产物特异性（角鲨烯的1'-1连接与botryococcene的1'-3连接）的氨基酸残基，并尝试通过定点突变互换产物特异性。

研究策略

基于同源建模和分子对接，识别活性位点中可能决定产物特异性的残基，构造BbSS与SSL-3之间的互惠突变体，通过体外和体内实验评估突变体的第一、第二反应步骤活性和产物特异性。

研究路线图

100%
研究问题：SSL-1/SSL-3产物特异性关键残基鉴定
策略：同源建模+分子对接识别活性位点关键残基
构建BbSS与SSL-3互惠突变体库
体外&体内活性与产物特异性评估
关键发现1：N171A/G207Q双突变完全转换SSL-3特异性
关键发现2：反向突变仅部分转换（相对效率46.1%）
关键发现3：DXXED基序对两步反应均重要；M11系列揭示PSPP保留机制
结论：N171/G207控制1'-1/1'-3连接，但额外残基影响完全特异性互换
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核心内容

该研究以产烃绿藻Botryococcus braunii Race B中的角鲨烯合酶（BbSS）及其类似酶SSL-3为对象，旨在解析控制催化产物特异性的关键氨基酸残基。研究者通过同源建模和分子对接预测活性位点中决定1'-1连接（角鲨烯）与1'-3连接（botryococcene）的残基，并构建BbSS与SSL-3之间的互惠定点突变体，在大肠杆菌中通过体外酶活测定和体内共表达评估突变体的催化性能。关键结果发现，SSL-3中的N171A/G207Q双突变可将其产物特异性从botryococcene完全转换为角鲨烯，相对催化效率为野生型SSL-3的70.1%和64.6%；而BbSS的反向突变（A177N/Q213G）仅保留46.1%活性，未能完全转化为botryococcene合酶，表明还存在其他非保守残基影响特异性。此外，DXXED基序突变同时损害第一和第二反应步骤，部分突变体丧失PSPP保留能力。这些结果揭示了控制碳正离子中间体重排的关键位点，为通过定点突变定向改造萜类合酶的产物特异性提供了依据。

创新点

首次报告SSL-3中的N171A和G207Q双突变能将其产物特异性从botryococcene完全转换为角鲨烯；揭示了这些残基在控制碳正离子中间体重排中的作用。

研究对象（7）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) 萜类合成通路 BbSS Botryococcus braunii squalene synthase 催化 双功能酶，催化FPP→PSPP→squalene
Escherichia coli BL21(DE3) 萜类合成通路 SSL-1 squalene synthase-like 1 催化 仅催化FPP→PSPP
Escherichia coli BL21(DE3) 萜类合成通路 SSL-2 squalene synthase-like 2 催化 推测与BbSS类似，催化squalene合成
Escherichia coli BL21(DE3) 萜类合成通路 SSL-3 squalene synthase-like 3 催化 仅催化PSPP→botryococcene
Escherichia coli BL21(DE3) MEP途径 DXS 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 催化 MEP途径限速酶，增强FPP前体供应
Escherichia coli BL21(DE3) MEP途径 IDI isopentenyl diphosphate isomerase 催化 IPP/DMAPP异构化，增强异戊二烯单元供应
Escherichia coli BL21(DE3) 萜类合成通路 FPS farnesyl diphosphate synthase 催化 合成FPP，底物供应

关键发现

  1. M4-10双突变体(N171A/G207Q)使SSL-3从botryococcene合酶变成角鲨烯合酶，相对催化效率为70.1%（方案A）和64.6%（方案B）与野生型SSL-3相比
  2. M3-11（BbSS的A177N/Q213G）相对效率为46.1%与BbSS相比
  3. M1-6突变(A177N)丧失第一反应步骤但保留第二反应步骤活性
  4. M3-8保留20%的FPP转化活性和35%的PSPP转化活性
  5. M11系列中M11-2和M11-6突变几乎完全丧失活性，M11-1、-3、-4、-5和-6突变体与SSL-3共表达时产生大量botryococcene，表明这些残基影响PSPP的保留。

研究结论

研究鉴定出SSL-3中决定1'-1与1'-3连接特异性的关键残基（N171和G207），但反向突变不能完全将角鲨烯合酶转化为botryococcene合酶，说明存在其他非保守残基或结构域影响催化特异性。此外，DXXED基序对第一和第二反应步骤均重要。