In Vitro Reconstitution of the Radical S-Adenosylmethionine Enzyme MqnC Involved in the Biosynthesis of Fatalosine-Derived Menaquinone
- 作者
- Lisa E. Cooper, Dmytro Fedoseyenko, Sameh H. Abdelwahed, Soong-Hyun Kim, Tohru Dairi, Tadhg P. Begley
- 单位
- Department of Chemistry, Texas A&M University; Graduate School of Engineering, Hokkaido University
- 杂志
- Biochemistry（2014）
- DOI
- 10.1021/bi400498d
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
MqnC酶的功能鉴定和催化机制尚不清楚，需要体外重构其活性并确定腺苷自由基从底物DHFL抽取氢原子的位点。
研究策略
将Bacillus halodurans C-125的mqnC基因与E. coli suf操纵子共表达于E. coli BL21(DE3)-T1R中，经厌氧纯化获得含铁硫簇的MqnC蛋白；化学合成DHFL和C4'位氘代DHFL，通过HPLC、LC-MS和EPR等检测方法验证MqnC催化DHFL转化为CDHFL，并利用氘标记示踪氢原子抽取位置。
核心内容
该研究体外重构了来自Bacillus halodurans C-125的radical SAM酶MqnC，旨在阐明其在fatalosine衍生甲萘醌生物合成中的催化功能与机制。通过将mqnC与E. coli suf操纵子共表达于BL21(DE3)-T1R菌株并经厌氧纯化，获得含铁硫簇的MqnC蛋白，其UV-vis光谱约410 nm处有特征吸收，EPR证实存在[4Fe-4S]+簇，纯化蛋白每单体含3个铁和2个硫化物。体外反应依赖连二亚硫酸盐、DHFL和SAM，LC-MS检测到产物CDHFL（m/z 293.1 [M-H]-），首次实现该酶活性重构。利用C4'位氘代DHFL（氘代率66%）进行示踪，发现5'-dAd分子量增加1 Da，而未被耦联的5'-dAd形成比例为10:1，证明5'-dA自由基特异抽取DHFL的C4'氢原子启动环化反应。该结果确立了MqnC催化DHFL转化为CDHFL的自由基机制，为理解fatalosine途径的甲萘醌生物合成提供关键酶学证据。
创新点
['首次实现radical SAM酶MqnC的体外活性重构', '证实MqnC催化DHFL环化生成CDHFL的反应', "利用位点特异性氘标记确定5'-dA自由基从DHFL的C4'位抽取氢原子"]
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)-T1R | fatalosine途径（甲萘醌生物合成） | mqnC（来自Bacillus halodurans C-125） | MqnC | 催化 | 在E. coli中异源表达并借助suf操纵子组装铁硫簇，体外催化DHFL转化为CDHFL |
关键发现
- 成功重构MqnC活性，其UV-vis光谱在约410 nm处有特征吸收，EPR显示存在[4Fe-4S]+簇
- 纯化蛋白每单体含3个铁和2个硫化物（不完全重构）。体外反应需依赖钠连二亚硫酸盐、DHFL、SAM和MqnC，产物CDHFL的质谱m/z为293.1 [M-H]-，与理论一致。使用[4-2H]-DHFL（氘代率66%）作为底物时，5'-dAd的质量增加1 Da，证明氢原子从DHFL的C4'被抽取
- 反应中未耦联的5'-dAd形成比例为10:1。
研究结论
MqnC是催化DHFL环化生成CDHFL的radical SAM酶，其催化过程通过5'-dA自由基抽取DHFL的C4'氢原子启动，推测了包含自由基中间体的反应机制。