Importance of the Methyl Group at C(10) of Squalene for Hopene Biosynthesis and Novel Carbocyclic Skeletons with 6/5 + 5/5 + (6) Ring System(s)
- 作者
- Tsutomu Hoshino, Shumi Ohashi
- 单位
- Department of Applied Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, and Graduate School of Science and Technology, Niigata University, Ikarashi, Niigata 950-2181
- 杂志
- Organic Letters（2002）
- DOI
- 10.1021/ol026180u
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
角鲨烯中心位置C(10)甲基在藿烯环化酶催化多环化反应中对底物正确折叠和骨架构建的作用尚不明确。
研究策略
化学合成缺失C(10)和C(15)甲基的角鲨烯类似物4，将其与来自嗜酸脂环芽孢杆菌的藿烯环化酶进行体外孵育，分离并解析酶促产物的结构，通过对比不同路径的产物推断甲基的作用。
核心内容
本研究通过化学合成缺失C(10)和C(15)甲基的角鲨烯类似物4，将其与来源于嗜酸脂环芽孢杆菌的藿烯环化酶进行体外孵育，以探究角鲨烯中心位置C(10)甲基在多环化反应中的作用。以50 mg底物类似物4孵育后，分离得到四种主要产物5、6、7、8，产量分别为16.8、3.8、10.5和7.3 mg，摩尔比约为4.4:1:2.8:1.9。结构解析表明，产物5和6具有前所未有的6/5+5/5环系，即B环与C环不稠合；产物7和8虽保留藿烷骨架，但7在C(21)位的立体化学与天然型8相反。EIMS特征碎片m/z 285和191进一步支持了上述环系归属。结果表明，C(10)甲基对于维持角鲨烯正确折叠并完成正常五环化反应不可或缺，其缺失显著改变环化级联路径并产生新型碳环骨架；同时，该工作区分了C(10)与C(15)去甲基化的不同影响，提示环化酶活性位点中与C(10)甲基匹配的疏水空腔尺寸对底物构象具有关键导向作用。
创新点
['首次发现C(10)去甲基角鲨烯可产生具有6/5+5/5+（6）全新三萜骨架的环化产物', '揭示了C(10)甲基对于维持角鲨烯正确折叠和完成正常五环化反应具有关键作用', '从实验中区分了C(10)与C(15)去甲基化的不同影响，提出了活性位点与甲基尺寸匹配的假说']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 重组大肠杆菌（E. coli） | 藿烯生物合成（角鲨烯-藿烯环化） | — | squalene-hopene cyclase (SHC) | 催化 | 来源于Alicyclobacillus acidocaldarius，重组表达用于体外孵育 |
| Alicyclobacillus acidocaldarius | 藿烯生物合成 | — | squalene-hopene cyclase (SHC) | 催化 | SHC的原始来源菌株 |
| — | 藿烯生物合成 | — | — | 催化 | 底物类似物4（C(10)/C(15)去甲基角鲨烯）在SHC催化下生成产物5-8 |
关键发现
- 以50 mg底物类似物4进行孵育，产物5、6、7、8的产量分别为16.8 mg、3.8 mg、10.5 mg、7.3 mg，回收底物9.0 mg
- 产物摩尔比5:6:7:8约为4.4:1:2.8:1.9。其中5和6具有前所未有的6/5+5/5环系（B环和C环不稠合），7和8为藿烷骨架，但7在C(21)立体化学与天然型8相反。EIMS碎片m/z 285（5、6）和m/z 191（7、8）支持环系结构。
研究结论
角鲨烯C(10)甲基是正确折叠并完成藿烯生物合成不可缺少的基团，其缺失会显著改变环化级联反应路径，产生新型碳环骨架；该研究也表明环化酶活性位点中与C(10)甲基相互作用的疏水空腔尺寸对底物构象具有关键导向作用。