Cell-free prediction of protein expression costs for growing cells
- 作者
- Olivier Borkowski, Carlos Bricio, Michela Murgiano, Brooke Rothschild-Mancinelli, Guy-Bart Stan, Tom Ellis
- 杂志
- Nature Communications（2018）
- DOI
- 10.1038/s41467-018-03970-x
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
异源蛋白表达会给宿主细胞带来显著负担，消耗表达资源，导致细胞生长变慢和生产力下降，但蛋白质生产成本很难从DNA序列直接预测。
研究策略
开发标准化的大肠杆菌无细胞裂解液测定法，以GFP生产速率变化相对测量蛋白质编码序列表达时的资源消耗，并将该测量值与核糖体流动翻译模型结合，预测生长中大肠杆菌的体内表达负担。
核心内容
本研究开发了一种结合无细胞裂解液测定与核糖体流动翻译模型的方法，用于预测异源蛋白在大肠杆菌中表达时造成的资源负担。研究者以GFP生产速率的变化作为容量监测指标，在标准化裂解液中定量不同编码序列的翻译资源消耗，并引入集总参数γ代表翻译效率，使该参数可快速从裂解液实验测得。体外与体内容量测量呈良好线性关系：mKate文库R²为0.74，10个不同基因的R²为0.76。利用γ参数与模型预测BCD21 RBS文库的体内负担R²达0.74，荧光素酶双基因操纵子负担预测R²为0.79。在β-胡萝卜素四基因操纵子预测中，主动代谢时R²为0.44，而失活CrtE后升至0.78，从而成功将表达负担与代谢负担分离。该方法为理性设计低负担、高产出的合成基因线路和代谢途径提供了无需大量体内筛选的预测工具。
创新点
['建立无细胞容量监测方法，通过GFP生产速率定量资源竞争', '引入集总参数γ代表翻译效率，使翻译效率可从裂解液实验快速测定', '将无细胞测定与翻译模型结合，成功预测单基因、多基因操纵子及代谢途径操作子的体内负担', '提出可区分表达负担与代谢负担的方法']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 DH10B | 基因表达容量监测 | sfGFP | superfolder GFP | 调控 | 基因组整合的表达容量监测器，由强组成型启动子J23100和强RBS驱动，用于测定细胞基因表达容量。 |
| 大肠杆菌 MG1655 | 基因表达容量监测 | sfGFP | superfolder GFP | 调控 | 与DH10B中相同的整合型容量监测器，用于不同菌株和生长条件下的对比。 |
| 无细胞大肠杆菌裂解液（源自DH5α） | 基因表达容量监测 | sfGFP | superfolder GFP | 调控 | 低拷贝数组成型表达sfGFP的质粒，用于体外容量监测；与测试质粒共同加入裂解液以评估资源竞争。 |
| 大肠杆菌 DH10B | 基因表达负担测试 | mKate | mKate（红色荧光蛋白） | 调控 | 与不同RBS序列组合，用于测定翻译起始效率对负担的影响；γ=1.4 s⁻¹（强RBS BCD2时）。 |
| 大肠杆菌 DH10B | 负担测试（来源：Violacein生物合成途径） | viob | VioB | 催化 | 来自Violacein途径的酶，含3种截短形式；γ=0.6 s⁻¹（融合mKate，强RBS时）。 |
| 大肠杆菌 DH10B | 荧光素生物合成 | Luciola cruciata 荧光素酶操纵子（2个基因） | 未在原文给出具体名称 | 催化 | 来自萤火虫Luciola cruciata的双基因操纵子，用于生物发光；γ值经无细胞测定确定。 |
| 大肠杆菌 DH10B | β-胡萝卜素生物合成 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPP合酶） | 催化 | 来自Erwinia uredovora，经大肠杆菌密码子优化；失活突变（DD→AA）用于区分代谢负担。 |
| 大肠杆菌 DH10B | β-胡萝卜素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，经密码子优化；催化GGPP形成八氢番茄红素。 |
| 大肠杆菌 DH10B | β-胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，经密码子优化；催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素。 |
| 大肠杆菌 DH10B | β-胡萝卜素生物合成 | crtY | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，经密码子优化；催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素。 |
关键发现
- 无细胞裂解液中表达容量在50 nM质粒DNA时达到平台并随后下降
- 在20 nM测试质粒+30 nM监测质粒条件下，翻译是主要资源限制。体外与体内容量测量呈良好线性关系：mKate文库R²=0.74，10个不同基因R²=0.76
- 利用γ参数和模型预测BCD21 RBS文库的体内负担R²=0.74。γ值示例：mKate为1.4 s⁻¹，viob-mKate为0.6 s⁻¹，监测GFP为1 s⁻¹。预测荧光素酶双基因操纵子负担R²=0.79
- 预测β-胡萝卜素四基因操纵子负担在主动代谢时R²=0.44，而失活CrtE后R²=0.78，从而可分离表达负担与代谢负担。
研究结论
标准化无细胞裂解液测定结合翻译模型，可预测大肠杆菌中不同设计多基因操纵子和代谢途径操作子的表达负担，并能区分表达负担与代谢负担，为理性设计低负担、高产出的合成基因线路和代谢途径提供了新工具。