Heterologous expression reveals the biosynthesis of the antibiotic pleuromutilin and generates bioactive semi-synthetic derivatives
- 作者
- Fabrizio Alberti, Khairunisa Khairudin, Edith Rodriguez Venegas, Jonathan A. Davies, Patrick M. Hayes, Christine L. Willis, Andy M. Bailey, Gary D. Foster
- 杂志
- Nature Communications（2017）
- DOI
- 10.1038/s41467-017-01659-1
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明担子菌抗生素pleuromutilin的生物合成途径，并通过异源表达实现中间体积累和生物活性半合成衍生物的生成。
研究策略
在米曲霉中逐步共表达来自Clitopilus passeckerianus的pleuromutilin基因簇基因，结合中间体分离、NMR和MS结构鉴定、化学合成标准品对比以及饲喂实验，解析每个基因的功能并构建可转化化学修饰类似物的平台。
核心内容
本研究在米曲霉NSAR1中逐步共表达了来自粉状侧耳的全部七个pleuromutilin生物合成基因（Pl-ggs、Pl-cyc、Pl-p450-1/2/3、Pl-sdr、Pl-atf），结合中间体分离、NMR/MS结构鉴定与饲喂实验，首次完整解析了担子菌来源抗生素pleuromutilin的合成途径，并明确了每个基因的功能。通过逐步表达，从1升培养物中分别获得了5 mg 14-醇、10 mg 11,14-二醇、18 mg 3,11,14-三醇、15 mg mutilin和6 mg 14-乙酸酯，证实3,11,14-三醇是途径中的真正中间体。在此基础上，将化学修饰的烯酮18饲喂给表达atf和p450-3的菌株，成功获得酯20（18 mg，产率51%）和羟基酯21（8 mg，产率23%）；抑菌实验显示21对枯草芽孢杆菌的抑菌圈为15.7±1.8 mm，明显高于pleuromutilin（12.8±0.8 mm）和14-乙酸酯（10.3±0.3 mm）。该研究不仅阐明了完整的生物合成基因步骤，证明担子菌天然产物可在子囊菌异源宿主中有效重构，还展示了将米曲霉工程化平台与化学合成相结合来产生具有增强抗菌活性的新型半合成衍生物的可行性。
创新点
首次完整解析pleuromutilin的生物合成途径并确定每个基因的功能；建立米曲霉作为生物转化平台，可将化学修饰的中间体转化为具有增强抗菌活性的半合成衍生物。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | Pl-ggs | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 提供GGPP前体 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | Pl-cyc | 双功能二萜合酶 | 催化 | 催化GGPP环化生成14-醇(2) |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | Pl-p450-1 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 催化C-11羟基化 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | Pl-p450-2 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 催化C-3羟基化 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | Pl-sdr | 短链脱氢酶/还原酶 | 催化 | 催化3-羟基氧化为酮 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | Pl-atf | 乙酰转移酶 | 催化 | 催化14-醇乙酰化生成6 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | Pl-p450-3 | 细胞色素P450氧化还原酶 | 催化 | 催化6羟基化生成pleuromutilin(1) |
关键发现
- 通过逐步表达基因，从1L培养物中分别获得5mg 14-醇(2)、10mg 11,14-二醇(3)、18mg 3,11,14-三醇(4)、15mg mutilin(5)和6mg 14-乙酸酯(6)
- 证实4是途径中的真正中间体
- 饲喂化学修饰的烯酮18给含atf和p450-3的AP3菌株，得到酯20 (18mg, 51%)和羟基酯21 (8mg, 23%)
- 21对枯草芽孢杆菌的抑菌圈为15.7±1.8mm，高于pleuromutilin (12.8±0.8mm)和6 (10.3±0.3mm)。
研究结论
本研究阐明了pleuromutilin生物合成的全部基因步骤，证明担子菌天然产物可在子囊菌异源宿主中重构，并展示了利用工程化米曲霉平台结合化学合成产生新型活性衍生物的潜力。