Metabolic engineering for drug discovery and development
- 作者
- Chaitan Khosla, Jay D. Keasling
- 单位
- Departments of Chemical Engineering, Chemistry and Biochemistry, Stanford University; Department of Chemical Engineering, University of California and Synthetic Biology Department, Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory
- 杂志
- Nature Reviews Drug Discovery（2003）
- DOI
- 10.1038/nrd1256
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
天然产物药物结构复杂、天然产量低、生产成本高，如何利用代谢工程手段改造生物合成途径，实现药物的高效发现、开发和规模化生产。
研究策略
综述代谢工程在四大类天然产物（异戊二烯、聚酮、非核糖体肽、碳水化合物）药物开发中的应用，包括异源表达、代谢通量平衡、模块化酶工程、组合生物合成及化学-酶法合成等策略。
核心内容
该综述系统梳理了代谢工程在天然产物药物发现与开发中的核心策略与应用。作者聚焦异戊二烯、聚酮、非核糖体肽和碳水化合物四类天然产物，总结了异源表达、代谢通量平衡、模块化酶工程、组合生物合成及化学-酶法合成等改造手段。关键结果包括：约60%的成功药物源自天然产物，但每个上市药物平均需5000至10000个候选化合物，研发周期长达10至15年；2002年全球萜类药物销售额约120亿美元，而青蒿素成本约为传统抗疟药的100倍。通过将生物合成基因簇转移至大肠杆菌、酿酒酵母等模式宿主，已实现6-脱氧红霉内酯B等复杂聚酮的异源生产；蛋白质工程方面，单个氨基酸替换即能改变P450羟化酶的底物区域选择性，如将柠檬烯-6-羟化酶转变为柠檬烯-3-羟化酶；来自大冷杉的蛇麻烯合酶单个酶可产生数十种倍半萜。该工作表明代谢工程已能高效生产天然产物类似物并构建组合生物合成库，有望加速未来市场化药物的开发。
创新点
将天然产物生物合成途径转移到模式异源宿主（如大肠杆菌、酿酒酵母、天蓝色链球菌等）中；利用聚酮合酶和非核糖体肽合成酶的模块化特性进行组合生物合成；通过蛋白质工程改变P450羟化酶的底物区域选择性；利用糖基转移酶的底物宽泛性制备新型糖基化天然产物；开发环化酶催化的化学-酶法大环内酯库构建。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成 | limonene-3-hydroxylase | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 将柠檬烯羟基化生成薄荷醇前体，需与NADPH-细胞色素P450还原酶共表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 异戊二烯生物合成 | limonene-6-hydroxylase | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 与limonene-3-hydroxylase功能互补，单氨基酸替换可改变区域选择性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 紫杉醇生物合成 | taxane-10β-hydroxylase | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 从红豆杉中克隆并在酵母中功能表达，参与紫杉醇生物合成 |
| Escherichia coli | 聚酮生物合成 | 6-deoxyerythronolide B synthase | 聚酮合酶(PKS) | 催化 | 合成6-脱氧红霉内酯B，需要外源供给丙酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A |
| Streptomyces coelicolor | 聚酮生物合成 | actinorhodin gene cluster | 聚酮合酶(PKS) | 催化 | 作为聚酮途径异源表达的模型宿主，基因组约1%用于聚酮生物合成 |
| Myxococcus xanthus | 聚酮生物合成 | epothilone gene cluster | 聚酮合酶(PKS) | 催化 | 产生抗肿瘤药物埃博霉素的天然宿主 |
| Penicillium chrysogenum | β-内酰胺类抗生素生物合成 | ADCA biosynthetic genes | 非核糖体肽合成酶系 | 催化 | 通过代谢工程直接发酵生产7-氨基脱乙酰氧头孢烷酸（ADCA） |
| Escherichia coli | 糖基化修饰 | gtfE, gtfD | 糖基转移酶GtfE/GtfD | 催化 | 来自万古霉素生物合成途径，可掺入葡萄糖类似物生成非天然糖肽 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸通路 | mevalonate pathway genes | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 异源甲羟戊酸途径可提高萜类前体异戊烯焦磷酸供应，但需平衡以避免前体积累毒性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 萜类合成 | terpene cyclase genes | 萜烯环化酶 | 催化 | 内源磷酸酶会使异戊烯焦磷酸去磷酸化，限制萜烯产量 |
关键发现
- 每个成功上市的药物平均需要5000-10000个候选化合物进入研发管线，开发周期为10-15年
- 约60%的成功药物源自天然产物
- 2002年全球萜类药物的销售额约为120亿美元
- 青蒿素成本约为氯喹、磺胺多辛和乙胺嘧啶的100倍
- 来自大冷杉的δ-蛇麻烯合酶和γ-蛇麻烯合酶分别能产生34种和52种倍半萜
- 单个氨基酸替换(F363)可将薄荷柠檬烯-6-羟化酶转变为柠檬烯-3-羟化酶
- 天蓝色链霉菌、枯草芽孢杆菌和结核分枝杆菌基因组中约1%的基因用于聚酮生物合成，而大肠杆菌基因组不含聚酮合成基因
- 在大肠杆菌中生产6-脱氧红霉内酯B需要供应丙酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A，其中丙酰辅酶A羧化酶途径提供的前体通量最高
- 天然产物纯化成本通常超过每克1000美元。
研究结论
代谢工程在过去十年中已成为天然产物药物发现与开发的重要工具，能够生产类似物及足够数量的目标化合物，并催生了基于组合生物合成的天然产物类库构建新方法。随着技术发展，未来十年代谢工程有望加速产生新的市场化药物，验证其在制药工业中的潜力。