Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system
- 作者
- Jiazhang Lian, Mohammad HamediRad, Sumeng Hu, Huimin Zhao
- 杂志
- Nature Communications（2017）
- DOI
- 10.1038/s41467-017-01695-x
- 所属领域
- 合成生物学 / 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
构建最优微生物细胞工厂需要同时过表达、敲低和敲除多个基因靶点，但传统方法顺序进行且通量低，缺乏便捷的多重基因组工程工具。
研究策略
开发基于正交三功能CRISPR系统的组合代谢工程策略（CRISPR-AID），利用三个正交CRISPR蛋白分别实现转录激活、转录干扰和基因删除，实现模块化、并行、高通量的代谢网络重构。
核心内容
该研究开发了一种基于正交三功能CRISPR系统的组合代谢工程策略（CRISPR-AID），在酿酒酵母中实现了多靶点的并行编辑。该系统利用三个正交CRISPR蛋白，即dLbCpf1-VP执行转录激活、dSpCas9-RD1152执行转录干扰、SaCas9执行基因删除，并通过单质粒共表达gRNA阵列与Cys4核糖核酸内切酶实现多重gRNA加工，避免了不同CRISPR系统间gRNA竞争。在报告菌株中，该系统可同时实现mCherry约5倍激活、mVenus约5倍干扰和ADE2大于95%的删除效率。将CRISPR-AID应用于β-胡萝卜素生产时，单gRNA使产量提高1.7倍，而HMG1激活、ERG9干扰和ROX1删除的三重组合使产量提高2.8倍。在纤维素酶分泌优化中，PDI1激活、MNN9干扰和PMR1删除的最优组合使展示水平和酶活提高2.5倍。通过FACS筛选1620种组合，发现干扰和删除靶点高度富集。该工作将三种基因操作模式整合于单一平台，显著提升了代谢网络重构的通量，为微生物细胞工厂的快速优化提供了有力工具。
创新点
['首次开发完全正交的三功能CRISPR系统（CRISPR-AID），使用三个独立CRISPR蛋白（dLbCpf1-VP、dSpCas9-RD1152、SaCas9）分别执行激活、干扰和删除，避免gRNA竞争。', '系统表征并优化了多个CRISPR蛋白在酵母中的活性，设计了高效的内源抑制结构域（RD1152）。', '通过单质粒共表达gRNA阵列和Cys4核糖核酸内切酶实现多重gRNA加工，同时实现三功能。', '将CRISPR-AID应用于理性和组合代谢工程，探索了多重基因组修饰的协同效应。']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | HMG1 | Hmg1p（HMG-CoA还原酶） | 催化 | 限速酶，通过CRISPRa激活以增强β-胡萝卜素前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/甾醇合成分支 | ERG9 | 鲨烯合酶 | 催化 | 分支点关键酶，通过CRISPRi下调以减少碳流分流 |
| Saccharomyces cerevisiae | 应激响应调节 | ROX1 | Rox1p（转录调控因子） | 调控 | 应激相关转录抑制因子，通过CRISPRd删除以提升类胡萝卜素产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 蛋白质分泌/折叠 | PDI1 | 蛋白二硫键异构酶 | 催化 | 通过CRISPRa激活以增强重组蛋白折叠和分泌 |
| Saccharomyces cerevisiae | N-糖基化 | MNN9 | 甘露糖基转移酶复合物亚基 | 催化 | 通过CRISPRi下调以减少过度糖基化，提高EGII展示 |
| Saccharomyces cerevisiae | 离子转运 | PMR1 | 高尔基体钙转运ATP酶 | 转运 | 通过CRISPRd删除以提高蛋白分泌和展示水平 |
| Saccharomyces cerevisiae | 报告系统 | mCherry | mCherry荧光蛋白 | 调控 | CRISPRa报告基因，受CYC1p驱动 |
| Saccharomyces cerevisiae | 报告系统 | mVenus | mVenus荧光蛋白 | 调控 | CRISPRi报告基因，受TEF1p驱动 |
| Saccharomyces cerevisiae | 腺嘌呤生物合成 | ADE2 | ADE2（磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶） | 催化 | CRISPRd报告基因，破坏后菌落呈红色 |
| Saccharomyces cerevisiae | CRISPR系统 | dSpCas9-RD1152 | dSpCas9融合RD11-RD5-RD2抑制结构域 | 调控 | 用于CRISPRi，最优抑制模块 |
| Saccharomyces cerevisiae | CRISPR系统 | dLbCpf1-VP | dLbCpf1融合VP64-p65AD激活结构域 | 调控 | 用于CRISPRa，最优激活模块 |
| Saccharomyces cerevisiae | CRISPR系统 | SaCas9 | SaCas9核酸酶 | 催化 | 用于CRISPRd，基因删除 |
关键发现
['在报告菌株中，dSpCas9-VPR实现mCherry表达超过5倍激活，dSpCas9-MXI1实现mVenus约10倍干扰，SpCas9实现ADE2近100%删除。', '优化后的CRISPR-AID单质粒同时实现mCherry 5倍激活、mVenus 5倍干扰和ADE2大于95%删除。', 'β-胡萝卜素生产中，单gRNA使产量提高1.7倍，三gRNA组合（HMG1激活、ERG9干扰、ROX1删除）使产量提高2.8倍。', '组合代谢工程中，PDI1激活、MNN9干扰和PMR1删除的最优组合使EGII展示水平和纤维素酶活性提高2.5倍。', '单因素优化组合（ERO1激活、PMR1干扰、ROX1删除）未产生正效应，凸显组合优化的重要性。', 'FACS筛选1620种组合，发现干扰和删除靶点高度富集。']
研究结论
本研究开发了三功能CRISPR-AID系统，将转录激活、转录干扰和基因删除整合于一个平台，成功用于酵母的理性和组合代谢工程，并揭示了多重基因组修饰间的协同相互作用，为微生物细胞工厂的快速优化提供了有力工具。