Multidimensional heuristic process for high-yield production of astaxanthin and fragrance molecules in Escherichia coli

作者: Congqiang Zhang, Vui Yin Seow, Xixian Chen, Heng- Phon Too
杂志: Nature Communications（2018）
DOI: 10.1038/s41467-018-04211-x
所属领域: 代谢工程/合成生物学
关键词: 代谢工程多维启发式过程大肠杆菌异戊二烯途径虾青素
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解决的核心问题

优化包含大量基因的代谢途径时，传统多元模块化方法（MMM）仅能平衡模块间而无法平衡模块内酶活，导致虾青素等复杂化合物产量低。

研究策略

开发多维启发式过程（MHP），通过启动子强度全局调控模块转录，利用RBS和酶变体局部协调模块内活性，并顺序优化番茄红素、β-胡萝卜素和虾青素，结合培养基颜色筛选和原位萃取提高产量。

研究路线图

100%

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核心内容

针对包含大量基因的复杂代谢途径，传统多元模块化方法难以平衡模块内酶活，导致虾青素等产物产量偏低。该研究在大肠杆菌中开发了一种多维启发式过程（MHP），通过启动子强度全局调控模块转录，并利用RBS和酶变体局部协调模块内活性，实现对番茄红素、β-胡萝卜素和虾青素合成途径的顺序优化。研究发现虾青素可高效跨膜扩散，据此利用培养基上清颜色进行高准确度筛选，并采用同时发酵-萃取（SFE）工艺进一步提升产量。最终，MHP将虾青素产量提高至320 mg/L，比藻类法高16倍，且为100% 3S,3'S-对映体；橙花叔醇和芳樟醇产量分别达323 mg/L和65 mg/L，较初始菌株提高10倍和28倍。该结果表明，MHP能有效平衡模块内酶活与模块间通量，显著提升复杂代谢途径中产物的产量和纯度，并具备推广至其他生化途径的潜力。

创新点

['提出MHP方法，融合全局启动子调控与局部RBS/酶变体多维优化', '发现虾青素可高效跨膜扩散，利用培养基上清颜色进行高准确度筛选', '采用同时发酵-萃取（SFE）工艺进一步提升产量和简化提取']

研究对象（16）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	MVA途径	atoB	乙酰乙酰CoA硫解酶	催化	催化乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	MVA途径	hmgS	HMG-CoA合酶	催化	催化乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合生成HMG-CoA
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	MVA途径	thmgR	截短HMG-CoA还原酶	催化	催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	MVA途径	mevk	甲羟戊酸激酶	催化	催化甲羟戊酸磷酸化
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	MVA途径	pmk	磷酸甲羟戊酸激酶	催化	催化磷酸甲羟戊酸进一步磷酸化
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	MVA途径	pmd	甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶	催化	催化甲羟戊酸焦磷酸脱羧生成IPP
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	MVA途径	idi	异戊烯基焦磷酸异构酶	催化	催化IPP异构化为DMAPP
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	MVA途径/萜类前体	ispA	法尼基焦磷酸合酶	催化	催化IPP和DMAPP缩合生成FPP
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	类胡萝卜素合成途径	crtE	香叶基香叶基焦磷酸合酶	催化	催化FPP延伸生成GGPP
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	类胡萝卜素合成途径	crtB	八氢番茄红素合酶	催化	催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	类胡萝卜素合成途径	crtI	八氢番茄红素脱氢酶	催化	引入共轭双键，生成番茄红素
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	类胡萝卜素合成途径	crtY	番茄红素环化酶	催化	催化番茄红素两端环化生成β-胡萝卜素；研究中比较了来自Pantoea ananatis LMG20103和海洋细菌HF10_19P19的两个版本
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	类胡萝卜素合成途径	crtZ	β-胡萝卜素羟化酶	催化	催化β-胡萝卜素C3位羟基化；研究中使用了来自Sulfolobus solfataricus P2和Pantoea ananatis LMG20103的变体
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	类胡萝卜素合成途径	crtW	β-胡萝卜素酮醇酶	催化	催化β-胡萝卜素C4位引入酮基；研究中使用了来自Anabaena variabilis ATCC 29413和Brevundimonas sp. SD212的变体
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	萜类合成途径	nls	橙花叔醇/芳樟醇合酶	催化	来自Agrocybe aegerita的双功能合酶，可产生橙花叔醇和芳樟醇
Escherichia coli K12 MG1655 ΔrecA-ΔendAΔaroAΔaroBΔaroC DE3	萜类合成途径	GPPS	香叶基焦磷酸合酶	催化	来自Abies grandis，催化IPP和DMAPP生成GPP

关键发现

MHP将虾青素产量提高至184 mg L-1 day-1（或320 mg L-1），且为100% 3S,3'S-对映体
番茄红素最高71.3 mg/L，β-胡萝卜素100.3 mg/L
最佳菌株E虾青素62 mg/L（纯度83%）
在生物反应器中，通过SFE使虾青素总产量达320 mg/L，产量比藻类法高16倍
橙花叔醇产量323 mg/L（提高10倍），芳樟醇65 mg/L（提高28倍）。

研究结论

MHP是一种有效的多维启发式工艺优化方法，能够显著提高复杂代谢途径中产物的产量和纯度，并有望推广至其他生化途径。