In vitro DNA SCRaMbLE
- 作者
- Yi Wu, Rui-Ying Zhu, Leslie A. Mitchell, Lu Ma, Rui Liu, Meng Zhao, Bin Jia, Hui Xu, Yun-Xiang Li, Zu-Ming Yang, Yuan Ma, Xia Li, Hong Liu, Duo Liu, Wen-Hai Xiao, Xiao Zhou, Bing-Zhi Li, Ying-Jin Yuan, Jef D. Boeke
- 杂志
- Nature Communications（2018）
- DOI
- 10.1038/s41467-018-03743-6
- 所属领域
- 合成生物学/代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
开发一种体外DNA重排方法，以构建结构变异文库并优化生物合成途径的通量，克服体内SCRaMbLE系统的局限性。
研究策略
利用Cre重组酶与含loxPsym位点的纯化DNA在试管中反应，实现DNA结构重排。包括自上而下（top-down）和自下而上（bottom-up）两种策略，通过表型-基因型关联优化β-胡萝卜素生物合成途径。
核心内容
本研究开发了一种体外DNA SCRaMbLE重排方法，利用Cre重组酶与含loxPsym位点的纯化DNA在试管中反应，以构建结构变异文库并优化生物合成途径通量。研究采用自上而下和自下而上两种策略，分别对现有β-胡萝卜素生物合成途径进行重排及插入候选基因，通过表型-基因型关联筛选高产菌株。实验表明，重组效率与loxPsym位点数正相关，43个位点的构建体缺失频率约70%；PacBio测序检测到94种独特通路结构，转化酵母后17种结构中4株β-胡萝卜素产量提升3.5至5.1倍，最佳菌株yYW0399产量达1.7 μg/mg干重，为原始构建体的5.1倍，优于随机突变（3.1倍）和ARTP（3.9倍）。此外，qPCR分析揭示crtI是限速步骤，额外插入一个crtI拷贝可进一步提高产量。该体外系统具有热灭活、时间可控等优势，为代谢途径的快速优化和结构-功能关系解析提供了高效工具。
创新点
1. 首次建立体外SCRaMbLE系统，通过Cre/loxPsym实现DNA结构变异文库构建；2. 两种策略（top-down和bottom-up）可分别用于现有途径重排和候选基因插入；3. 体外反应可热灭活、时间可控，比体内系统更易控制；4. 实现表型-基因型的直接关联。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | β-胡萝卜素生物合成途径 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，催化GGPP合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | β-胡萝卜素生物合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，限速步骤，其额外拷贝可提高β-胡萝卜素产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | β-胡萝卜素生物合成途径 | crtYB | 番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶融合蛋白 | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 来自Saccharomyces cerevisiae，截短形式，额外拷贝使菌落呈亮黄色 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | ERG10 | 乙酰-CoA乙酰转移酶 | 催化 | 内源基因，作为bottom-up SCRaMbLE候选供体TU |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | ERG13 | HMG-CoA合酶 | 催化 | 内源基因，候选供体TU |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | ERG12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 内源基因，候选供体TU |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | ERG8 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 内源基因，候选供体TU |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | MVD1 | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 | 催化 | 内源基因，候选供体TU |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 内源基因，候选供体TU |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | BTS1 | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 内源基因，候选供体TU |
| 体外无细胞体系 | DNA重组 | cre | Cre重组酶 | 催化 | 来自噬菌体P1，催化loxPsym位点间的定向重组，是体外SCRaMbLE的核心酶 |
关键发现
- 体外SCRaMbLE实验中，10个loxPsym位点间隔500 bp的构建体产生9种不同缺失条带
- pLM495（4个基因，5个loxPsym位点）SCRaMbLE后约27%的菌落有至少一个缺失事件，约28%有倒位事件
- synIXR-BAC（43个loxPsym位点）的缺失频率约70%，表明重组效率与loxPsym位点数正相关
- PacBio测序检测到94种独特通路结构
- 17种独特结构转化酵母后，其中4株β-胡萝卜素产量提高3.5-5.1倍，最佳菌株yYW0399产量1.7 μg/mg干重，为原始构建体的5.1倍
- 与随机突变（error-prone PCR）和ARTP相比，体外SCRaMbLE获得更高产量提升（最高5.1倍 vs 3.1倍和3.9倍）
- bottom-up策略中，插入两个或更多供体片段的频率为12%至约20%（增加供体/载体摩尔比时）
- 额外一个crtI拷贝提高产量，两个拷贝不进一步提高
- 连续传代100代后，携带两个或三个TUs的构建体出现1/159和5/120的重组事件
- qPCR显示crtI是限速步骤。
研究结论
体外SCRaMbLE是一种高效、可控的DNA文库构建和途径优化方法，能够产生结构变异并改善代谢途径通量，优于传统随机突变和体内SCRaMbLE，并适用于多种宿主。