Novofumigatonin biosynthesis involves a non- heme iron-dependent endoperoxide isomerase for orthoester formation
- 作者
- Yudai Matsuda, Tongxuan Bai, Christopher B.W. Phippen, Christina S. Nadvig, Inge Kjærbølling, Tammi C. Vesth, Mikael R. Andersen, Uffe H. Mortensen, Charlotte H. Gotfredsen, Ikuro Abe, Thomas O. Larsen
- 杂志
- Nature Communications（2018）
- DOI
- 10.1038/s41467-018-04983-2
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
解析novofumigatonin的生物合成途径，揭示其独特的orthoester官能团形成的分子机制。
研究策略
通过CRISPR-Cas9基因敲除、在米曲霉中的异源表达以及体外酶活测定相结合的方法，系统解析生物合成途径并鉴定关键酶。
核心内容
该研究通过CRISPR-Cas9基因敲除、米曲霉异源表达及体外酶活测定，系统解析了novofumigatonin的完整生物合成途径。研究发现NvfI为内过氧化酶，催化asnovolin A生成内过氧化物fumigatonoid A；NvfE为内过氧化物异构酶，催化fumigatonoid B异构化为fumigatonoid C，该反应仅需底物和酶，不依赖α-酮戊二酸和外源铁，20 mM EDTA处理也不受影响。值得注意的是，NvfE虽与非血红素铁/α-酮戊二酸依赖双加氧酶同源，但已失去α-酮戊二酸结合能力而获得异构酶活性，是首例该类酶。随后NvfF催化fumigatonoid C经两步氧化生成终产物novofumigatonin，氢解中间体15的产率达到82%。通过在米曲霉中异源表达13个nvf基因，成功实现了novofumigatonin的全生物合成。该工作揭示了orthoester官能团形成的新机制，同时为将α-酮戊二酸依赖酶工程化为不依赖α-酮戊二酸的生物催化剂提供了重要思路。
创新点
首次阐明novofumigatonin的完整生物合成途径；发现NvfI为内过氧化酶，NvfE为内过氧化物异构酶，其中NvfE虽与非血红素铁/α-酮戊二酸依赖双加氧酶同源，但失去了α-酮戊二酸结合能力而获得异构酶活性，是首例该类酶；实现了novofumigatonin在异源宿主中的全生物合成。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus novofumigatus | novofumigatonin biosynthesis | nvfA | NvfA | 催化 | 聚酮合酶，催化合成DMOA |
| Aspergillus novofumigatus | novofumigatonin biosynthesis | nvfB | NvfB | 催化 | 法尼基转移酶，催化DMOA法尼基化 |
| Aspergillus novofumigatus | novofumigatonin biosynthesis | nvfC | NvfC | 催化 | 3-羟基脱氢酶，催化8氧化 |
| Aspergillus novofumigatus | novofumigatonin biosynthesis | nvfD | NvfD | 催化 | α/β水解酶，可能具有表异构酶活性，催化14转化为20 |
| Aspergillus novofumigatus | novofumigatonin biosynthesis | nvfE | NvfE | 催化 | 非血红素铁依赖内过氧化物异构酶，催化15生成26，不依赖αKG |
| Aspergillus novofumigatus | novofumigatonin biosynthesis | nvfF | NvfF | 催化 | Fe(II)/αKG依赖双加氧酶，催化26氧化生成1 |
| Aspergillus novofumigatus | novofumigatonin biosynthesis | nvfG | NvfG | 催化 | 酮还原酶，催化20还原为15 |
| Aspergillus novofumigatus | novofumigatonin biosynthesis | nvfH | NvfH | 催化 | FMO，Baeyer-Villiger单加氧酶 |
| Aspergillus novofumigatus | novofumigatonin biosynthesis | nvfI | NvfI | 催化 | 甲基转移酶（早期）和Fe(II)/αKG依赖内过氧化酶（后期），催化2生成14 |
| Aspergillus novofumigatus | novofumigatonin biosynthesis | nvfK | NvfK | 催化 | FMO，催化4环氧化 |
| Aspergillus novofumigatus | novofumigatonin biosynthesis | nvfL | NvfL | 催化 | 萜烯环化酶，催化7环化为8 |
| Aspergillus novofumigatus | novofumigatonin biosynthesis | nvfM | NvfM | 催化 | 烯酰还原酶，催化12还原为2 |
关键发现
- NvfI催化asnovolin A (2)生成内过氧化物fumigatonoid A (14)和次要产物22
- NvfE催化fumigatonoid B (15)异构化为fumigatonoid C (26)，该反应不需要α-酮戊二酸和外源铁，20 mM EDTA不抑制，仅需底物和酶
- NvfF催化26经两步氧化生成novofumigatonin (1)。氢解15得到产物16，产率为82%。异源表达13个nvf基因成功在米曲霉中产生1。
研究结论
本研究揭示了novofumigatonin的生物合成途径，发现了一种新型的非血红素铁依赖内过氧化物异构酶NvfE，它通过失去α-酮戊二酸结合位点而进化出异构酶活性，为orthoester的生物合成提供了新机制，并为工程化α-酮戊二酸依赖酶成为不依赖α-酮戊二酸的生物催化剂提供了思路。