Engineered bidirectional promoters enable rapid multi-gene co-expression optimization
- 作者
- Thomas Vogl, Thomas Kickenweiz, Julia Pitzer, Lukas Sturmberger, Astrid Weninger, Bradley W. Biggs, Eva-Maria Köhler, Armin Baumschläger, Jasmin Elgin Fischer, Patrick Hyden, Marlies Wagner, Martina Baumann, Nicole Borth, Martina Geier, Parayil Kumaran Ajikumar, Anton Glieder
- 杂志
- Nature Communications（2018）
- DOI
- 10.1038/s41467-018-05915-w
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
多基因共表达需要精细调控各基因的表达水平与比例，但传统单向启动子（MDP）在多基因共表达优化方面存在局限，缺乏覆盖广、可调性强的双向启动子工具。
研究策略
以毕赤酵母天然双向组蛋白启动子为模板，综合运用截短删除、MDP双向化、不同调控模块融合以及杂合启动子组装等模块化设计策略，构建了168个合成双向启动子库，并结合双向终止子实现多基因通路的快速组装与优化。
核心内容
本研究以毕赤酵母天然双向组蛋白启动子为模板，通过截短删除、单向启动子双向化、调控模块融合及杂合组装等模块化策略，构建了包含168个合成双向启动子的文库，覆盖79倍累积表达范围和61倍双向表达比。研究发现组蛋白双向启动子具有短核心区且表达强劲，其中HHX2删除变体可覆盖15倍累积表达和39倍比例范围，在甘油上其强度比GAP启动子高1.6倍。作者首次提出“每bp启动子长度表达强度”指标，证明合成双向启动子的效率比天然单向启动子高3.3倍。结合双向终止子可恢复50–90%的荧光损失，显著简化多基因通路组装。在紫杉二烯合成中，最优产量达6.2 mg/L，比最差设计高出50倍；在β-胡萝卜素合成中，双向设计产量比AOX1单向启动子设计高2倍、比GAP设计高14.9倍。该文库策略基于保守的组蛋白启动子架构，可望推广至其他真核生物，为多基因共表达的快速优化提供了通用工具。
创新点
1. 构建了168个合成双向启动子文库，覆盖79倍累积表达范围和61倍双向表达比；2. 发现组蛋白双向启动子具短核心启动子且表达强，可用于模块化工程；3. 首次提出“每bp启动子长度表达强度”指标，证明合成BDPs效率比天然MDPs高3.3倍；4. 结合双向终止子简化多基因通路组装，在紫杉二烯和β-胡萝卜素合成中验证了快速优化能力。
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 组蛋白基因表达 | HTX1 (HTA1-HTB1 locus) | 组蛋白H2A/H2B | 调控 | 天然双向组蛋白启动子，两翼表达强 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 组蛋白基因表达 | HHX1 (HHT1-HHF1 locus) | 组蛋白H3/H4 | 调控 | 天然双向组蛋白启动子 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 组蛋白基因表达 | HHX2 (HHT2-HHF2 locus) | 组蛋白H3/H4 | 调控 | 用于截短突变生成变体 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 甲醇利用 | AOX1 | 醇氧化酶1 | 调控 | 甲醇诱导型强启动子，被双向化 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 甲醇利用 | DAS1/DAS2 | 二羟丙酮合酶 | 调控 | 天然双向启动子，甲醇诱导，双向均强 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 甲醇利用 | CAT1 | 过氧化氢酶 | 调控 | 去阻遏/甲醇诱导启动子 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 甲醇利用 | FLD1 | 甲醛脱氢酶 | 调控 | 去阻遏/甲醇诱导启动子，双向化成功 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 甲醇利用 | GAP | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 调控 | 组成型强启动子，用作基准 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 紫杉二烯生物合成 | GGPPS | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 与TDS共表达，受双向启动子调控 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 紫杉二烯生物合成 | TDS | 紫杉二烯合酶 | 催化 | 与GGPPS共表达，最优启动子为P_GAP-CAT1 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | β-胡萝卜素生物合成 | crtE | 香叶基香叶基二磷酸合酶（细菌） | 催化 | 四基因途径之一 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | β-胡萝卜素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 四基因途径之一 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | β-胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 四基因途径之一 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | β-胡萝卜素生物合成 | crtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 四基因途径之一 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 人细胞色素P450系统 | CYP2D6 | 细胞色素P450 2D6 | 催化 | 与CPR共表达，最佳BDP为P_DAS1-DAS2反向 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 人细胞色素P450系统 | CPR | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 催化 | 提供电子，与CYP2D6共表达 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 蛋白质分泌/折叠 | PDI | 蛋白质二硫键异构酶 | 催化 | 帮助CalB正确折叠 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 蛋白质分泌 | CalB | 南极假丝酵母脂肪酶B | 催化 | 分泌表达，与PDI共表达优化 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 甲醇代谢调控 | Mxr1p | 甲醇表达调节因子1 | 调控 | 甲醇主调控转录因子，其结合位点被用于杂合启动子设计 |
| Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris) | 转录终止 | 天然BDT（如IDP1-PEX19间） | 无 | 调控 | 双向终止子，用于多基因组装 |
关键发现
- 构建了168个合成双向启动子，覆盖79倍累积表达范围和61倍双侧表达比
- 组蛋白启动子HHX2删除变体覆盖>15倍累积表达和39倍比例
- 在甘油上组蛋白BDP比GAP启动子强1.6倍
- 双向化AOX1等启动子获得高表达
- 紫杉二烯最优产量6.2 mg/L，比最差0.1 mg/L高50倍
- β-胡萝卜素双向设计最高产量比AOX1单启动子设计高2倍，比GAP设计高14.9倍
- 每bp表达强度上杂合BDP比nMDP高3.3倍，比nBDP高2.1倍
- 双向终止子恢复50-90%的荧光损失。
研究结论
本研究通过模块化设计策略构建了一个包含168个双向启动子的文库，能够覆盖广泛的表达强度、比例和调控模式，显著简化并加速多基因共表达的优化过程，且该策略基于保守的组蛋白启动子架构，有望推广到其他真核生物。