高级醇 · 代谢工程文献库

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Phenotypic diversification by enhanced genome restructuring after induction of multiple DNA double-strand breaks

作者
Nobuhiko Muramoto, Arisa Oda, Hidenori Tanaka, Takahiro Nakamura, Kazuto Kugou, Kazuki Suda, Aki Kobayashi, Shiori Yoneda, Akinori Ikeuchi, Hiroki Sugimoto, Satoshi Kondo, Chikara Ohto, Takehiko Shibata, Norihiro Mitsukawa, Kunihiro Ohta
杂志
Nature Communications（2018）
DOI
10.1038/s41467-018-04256-y
所属领域
合成生物学
关键词
DNA双链断裂TAQing系统基因组重排多倍体表型多样化
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解决的核心问题

探究同时诱导多个DNA双链断裂对基因组重排和表型多样性的影响，并开发一种可人工诱导基因组大范围重排的技术，以加速菌株和植物的定向进化与育种。

研究策略

利用来自嗜热菌的、具有温度依赖活性的限制酶TaqI，在酵母和拟南芥细胞内条件性表达并在热激活后于基因组上同时引入多个DSB；通过高通量重测序、染色体脉冲场凝胶电泳、tiling阵列等分析重排类型，并评估不同倍性下的重排频率与表型变化。

研究路线图

100%
研究问题：多DSB诱导基因组重排与表型多样性的机制
策略：构建TAQing系统（热激活TaqI）在酵母和拟南芥中诱导多DSB
关键改造1：条件性表达TaqI（热激活，TCGA位点切割）
关键改造2：比较不同倍性（单倍体/二倍体酵母，二倍体/四倍体拟南芥）
关键改造3：高通量重测序+PFGE+tiling阵列分析重排类型
结果（酵母）：二倍体28.1%染色体改变，HR提高18倍，40个基因转换，6个易位
结果（拟南芥）：AtRAD51上调10倍，HR增加20倍；四倍体非整倍体率46.3%，CNV丰富
表型验证：TAQed菌株木糖产乙醇稳定；拟南芥突变体茎长+30%，生物量+40%
结论：TAQing系统可实现人工诱导大范围基因组重排，加速定向进化和育种
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核心内容

本研究开发了TAQing系统，通过热激活来自嗜热菌的TaqI限制酶在酵母和拟南芥细胞内同时引入多个DNA双链断裂，以探究基因组重排对表型多样性的影响。该系统利用温度依赖性酶活实现条件性诱变，结合高通量重测序、脉冲场凝胶电泳和tiling阵列全面分析重排类型。结果显示，二倍体酵母中28.1%出现染色体大小改变而单倍体为0%，同源重组频率提高18倍，并检测到40个短基因转换和6个断点位于TaqI识别位点的非同源易位。TAQed融合菌株在40°C木糖培养基中稳定生长且乙醇产量与葡萄糖相当。在拟南芥中，AtRAD51表达上调约10倍，重组报告显示HR增加超过20倍；TAQed突变体茎长增加30%、生物量干重增加40%，且四倍体植物茎长方差比二倍体大4.3倍，46.3%四倍体出现非整倍体。该工作证明倍性越高，DSB诱导的重排频率和表型多样性越显著，TAQing系统可作为人工基因组重构工具，为快速基因组育种和代谢工程提供新策略。

创新点

开发了TAQing系统，通过热激活TaqI在体内诱导多DSB，实现大规模基因组重排；首次系统比较了不同倍性（单倍体/二倍体酵母、二倍体/四倍体拟南芥）对DSB诱导重排的响应；获得了稳定遗传且具有优良农艺/发酵性状的酵母和拟南芥突变体。

研究对象（8）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） DNA损伤修复 RAD51 Rad51 催化 介导同源重组修复
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） DNA损伤修复 RAD53 Rad53 调控 DNA损伤检查点激酶
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） DNA损伤修复 RAD9 Rad9 调控 DNA损伤检查点介导因子
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） DNA损伤修复 REV3 Rev3 催化 DNA聚合酶ζ催化亚基，参与跨损伤合成
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 基因组DNA代谢 taqI TaqI限制性内切酶 催化 来自Thermus thermophilus HB8，温度依赖性，识别TCGA位点，用于诱导DSB；dTaqI为D142A失活突变体
拟南芥（Arabidopsis thaliana） DNA损伤修复 AtRAD51 AtRAD51 催化 DSB修复相关重组酶
拟南芥（Arabidopsis thaliana） DNA损伤修复 AtBRCA1 AtBRCA1 调控 DNA修复调控因子
大肠杆菌（Escherichia coli） 重组蛋白表达 taqI 6xHis-TaqI 催化 用于体外表达和纯化TaqI蛋白

关键发现

  1. TaqI激活后，二倍体酵母中28.1%（9/32）出现染色体大小改变，而单倍体为0%（0/16），对照组为3.1%（1/32）；细胞存活率：单倍体约20%，二倍体约40%；同源重组频率提高18倍；13个突变体平均每个菌株1.3个SNV；检测到40个短基因转换（平均长度7.0 kb）、6个非同源易位（断点均在TaqI识别位点）
  2. 2%（11/178）的菌株出现絮凝变化；TAQed融合菌株在40°C木糖培养基中稳定生长，乙醇产量与葡萄糖相当；拟南芥中AtRAD51表达上调约10倍，GUS重组报告显示HR增加>20倍；TAQed拟南芥突变体#13和#19茎长增加30%，生物量干重增加40%；四倍体TAQed植物茎长方差比二倍体大4.3倍（σ²=6.65e-2 vs
  3. 53e-2）
  4. 3%（37/80）的四倍体TAQed植物出现非整倍体，而二倍体为0
  5. 3%（9/80）的四倍体TAQed植物有大CNV事件（共22个），对照为0。

研究结论

研究证明同时诱导多个DNA双链断裂能高效引发基因组重排，且倍性越高重排频率和表型多样性越显著。TAQing系统作为一种人工基因组重构技术，可用于快速基因组育种和基因组进化研究，对代谢工程也具有应用潜力。