Three previously unrecognised classes of biosynthetic enzymes revealed during the production of xenovulene A
- 作者
- Raissa Schor, Carsten Schotte, Daniel Wibberg, Jörn Kalinowski, Russell J. Cox
- 单位
- Leibniz Universität Hannover; Bielefeld University
- 杂志
- Nature Communications（2018）
- DOI
- 10.1038/s41467-018-04364-9
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析真菌meroterpenoid xenovulene A的生物合成途径，并鉴定参与其中的新型生物合成酶类。
研究策略
对产生菌进行基因组测序和转录组分析，结合基因敲除、在米曲霉中异源重构完整生物合成途径以及体外酶活测定，逐步解析各酶促步骤。
核心内容
该研究通过基因组测序、转录组分析、基因敲除、米曲霉异源重构及体外酶活测定，系统解析了真菌meroterpenoid xenovulene A的完整生物合成途径。研究将产生菌重新命名为Sarocladium schorii，其基因组约33.8 Mb，生物合成基因簇约49 kb。在米曲霉中异源表达最小基因集（含aspks1、asL1、asL3等8个基因）成功重构了xenovulene A的合成。途径由tropolone途径生成中间体17，AsR6催化FPP环化生成humulene，后者经AsR5催化的分子间杂Diels-Alder反应与tropolone缩合，再经AsL4/AsL6氧化开环收缩逐步去除碳原子，最终生成xenovulene A。研究发现了三种此前未识别的酶类：与已知萜烯环化酶无序列同源性的humulene合酶AsR6（48.5 kDa）、推测催化杂Diels-Alder反应的AsR5（52.5 kDa）以及新型氧化开环收缩酶AsL4/AsL6。体外实验表明，AsR6在5 mM Mg²⁺存在下可将150 μM FPP转化为humulene，20 mM EDTA可完全抑制其活性。Xenovulene A对GABA/苯并二氮卓受体具有40 nM的抑制活性。该工作揭示了真菌meroterpenoid生物合成的新机制，拓展了已知生物合成酶类的多样性。
创新点
发现三种此前未识别的酶类：AsR6（与已知萜烯环化酶无序列同源性的humulene合酶）、AsR5（推测催化分子间杂Diels-Alder反应的酶）、AsL4/AsL6（新型氧化开环收缩酶）；并将产生菌重新命名为Sarocladium schorii。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sarocladium schorii (formerly Acremonium strictum IMI 501407) | tropolone/meroterpenoid biosynthesis | aspks1 | 3-methylorcinaldehyde synthase (MOS) | 催化 | 非还原型聚酮合酶，合成3-甲基苔色醛4 |
| Sarocladium schorii | tropolone biosynthesis | asL1 | FAD-dependent salicylate hydroxylase | 催化 | 催化4的氧化脱芳构化生成15 |
| Sarocladium schorii | tropolone biosynthesis | asL3 | non-haem iron oxygenase | 催化 | 催化开环扩环生成tropolone类化合物 |
| Sarocladium schorii | tropolone/meroterpenoid biosynthesis | asR2 | cytochrome P450 monooxygenase | 催化 | 氧化生成不稳定的lactol 17及其衍生物 |
| Sarocladium schorii | sesquiterpene biosynthesis | asR6 | humulene synthase (terpene cyclase) | 催化 | 新型萜烯环化酶，催化FPP环化生成humulene，依赖Mg2+ |
| Sarocladium schorii | meroterpenoid biosynthesis | asR5 | putative hetero Diels-Alderase | 催化 | 推测催化tropolone与humulene的分子间杂Diels-Alder反应 |
| Sarocladium schorii | meroterpenoid biosynthesis | asL4 | NAD/FAD-dependent oxidoreductase | 催化 | 催化氧化开环收缩，与AsL6部分功能互补 |
| Sarocladium schorii | meroterpenoid biosynthesis | asL6 | NAD/FAD-dependent oxidoreductase | 催化 | 催化氧化开环收缩，与AsL4部分功能互补 |
| Sarocladium schorii | regulation of xenovulene BGC | asR3 | transcriptional regulator | 调控 | 推测为簇内转录调控因子 |
| Sarocladium schorii | transport | asL7 | ABC transporter | 转运 | ABC转运蛋白，可能参与产物外排 |
| Sarocladium schorii | transport | asR1 | MFS transporter | 转运 | 主要协助转运蛋白超家族转运蛋白 |
关键发现
- Xenovulene A对GABA/苯并二氮卓受体具有40 nM的抑制活性。基因组大小约33.8 Mb，scaffold N50为1.3 Mb
- 与已知Sarocladium物种的ANI低于97%，确认为新种。生物合成基因簇约49 kb。敲除实验43个转化子中仅1个aspks1敲除，互补恢复生产。在米曲霉中异源表达完整基因簇成功产生xenovulene A（1），最小基因集包含aspks1、asL1、asL3、asR2、asR5、asR6、asL4、asL6。AsR6和AsR5蛋白大小分别为48.5 kDa和52.5 kDa。体外实验表明AsR6在5 mM Mg2+存在下可将150 μM FPP转化为humulene，20 mM EDTA完全抑制活性。从野生型中分离了化合物7-13，其中9为113 mg、10为19 mg、11为9 mg、12为5 mg。
研究结论
阐明了xenovulene A的生物合成途径：由tropolone途径生成中间体17，AsR6催化FPP环化生成humulene，AsR5催化其与tropolone的分子间杂Diels-Alder反应形成12，随后AsL4和AsL6催化氧化开环收缩逐步去除碳原子，最终形成xenovulene A。该途径涉及三种新型生物合成酶类，揭示了真菌meroterpenoid生物合成的新机制。