Rapid pathway prototyping and engineering using in vitro and in vivo synthetic genome SCRAMbLE-in methods
- 作者
- Wei Liu, Zhouqing Luo, Yun Wang, Nhan T. Pham, Laura Tuck, Irene Pérez-Pi, Longying Liu, Yue Shen, Chris French, Manfred Auer, Jon Marles-Wright, Junbiao Dai, Yizhi Cai
- 杂志
- Nature Communications（2018）
- DOI
- 10.1038/s41467-018-04254-0
- 所属领域
- 合成生物学/代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
外源途径优化和底盘工程通常是分步进行且依赖试错法，耗时耗力。本文旨在通过一种基于重组酶的组合方法SCRAMbLE-in同时实现途径表达多样化和底盘基因组优化，加速工程生物学循环。
研究策略
开发双步骤SCRAMbLE-in系统：第一步利用体外纯化的重组酶（Cre、Dre、VCre）工具包，将多种启动子等调控元件整合到目标途径中，实现途径表达的快速原型化和多样化；第二步利用包含loxPsym位点和Cre重组酶的体内基因组重排系统，将组装好的途径随机整合到合成酵母染色体中，同时诱导大规模基因组重排，实现底盘菌株的进化与选择。
核心内容
本研究开发了一种名为SCRAMbLE-in的组合方法，旨在将外源途径的整合、表达多样化与底盘菌株的基因组进化整合为一步操作，以加速代谢工程的设计-构建-测试循环。该策略分为两步：第一步利用体外纯化的Cre、Dre、VCre重组酶，将多种启动子等调控元件整合入目标途径实现快速原型化；第二步借助含loxPsym位点的体内基因组重排系统，将组装好的途径随机整合进合成酵母染色体并诱导大规模重排。关键结果方面，研究鉴定出loxJT15/loxJTZ17突变对可将整合效率提高约3倍；在β-胡萝卜素途径中，SCRAMbLE-in菌株产量约500 μg/L，为对照的2倍；紫色杆菌素途径经连续SCRAMbLE后最佳菌株产量达16.8 mg/L，为对照的17倍。测序发现大量基因组重排，并关联了YBR044C基因缺失与产量下降。该工作证明SCRAMbLE-in能同时在途径层和基因组层进行快速优化，显著加速菌株工程进程。
创新点
['首次提出并验证SCRAMbLE-in方法，将体外途径多样化和体内基因组重排整合为一步操作。', '鉴定loxP突变对（loxJT15与loxJTZ17）可将体外整合效率提高约3倍，并降低整合位点对下游基因表达的影响。', '开发了正交可诱导重组酶系统（CrePBD和DreEBD），可通过RU486或β-雌二醇精确控制重组活性，为未来模块化基因组工程奠定基础。']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (synII synthetic strain) | β-胡萝卜素生物合成 | CrtI | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 将无色八氢番茄红素转化为番茄红素，是β-胡萝卜素途径的关键酶，作为体外启动子整合的靶标 |
| Saccharomyces cerevisiae | 紫色杆菌素生物合成 | VioA | L-色氨酸氧化酶 | 催化 | 紫色杆菌素途径的起始酶，催化L-色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸亚胺，作为启动子整合的靶标 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | Cre | Cre重组酶 | 催化 | 识别loxP位点，催化DNA重组，用于体外途径多样化和体内SCRAMbLE-in |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | Dre | Dre重组酶 | 催化 | 识别rox位点，与Cre正交，用于体外重组工具盒和正交诱导系统 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | VCre | VCre重组酶 | 催化 | 识别Vlox位点，与Cre正交，用于体外启动子整合 |
| Saccharomyces cerevisiae (synII synthetic strain) | 紫色杆菌素生物合成 | YBR044C | 线粒体膜蛋白（推测的分子伴侣） | 能量供给 | 参与琥珀酸脱氢酶复合物组装，缺失会导致紫色杆菌素产量下降，可能通过影响NADPH水平 |
| Saccharomyces cerevisiae | — | Cre (Cre-PBD融合) | Cre-PBD融合蛋白 | 催化 | 受RU486诱导，用于正交诱导型重组系统 |
| Saccharomyces cerevisiae | — | Dre (Dre-EBD融合) | Dre-EBD融合蛋白 | 催化 | 受β-雌二醇诱导，用于正交诱导型重组系统 |
关键发现
- 体外重组酶活性测定显示：Cre-loxP切除率>40%，VCre-Vlox和Dre-rox约30%
- 整合率Cre-loxP和Dre-rox约为0.6%，VCre-Vlox约0.3%。loxJT15与loxJTZ17配对整合率比野生型loxP提高约3倍。在β-胡萝卜素途径中，HO整合对照菌株LWy212的β-胡萝卜素产量约250 μg/L，而SCRAMbLE-in菌株LWy252约500 μg/L，提高约2倍
- 不同启动子整合菌株的胡萝卜素产量与启动子强度不呈线性相关，且菌株适合度各异。在紫色杆菌素途径中，HO整合对照LWy137产量约1 mg/L，SCRAMbLE-in菌株LWy152和LWy238约5 mg/L（约5倍），LWy239约10倍
- 连续SCRAMbLE后最佳菌株LWy256产量达16.8 mg/L，为LWy152的3倍以上、对照的17倍
- 而产量降低的菌株LWy257和LWy259降至约0.5 mg/L，为原来的1/10。测序分析发现SCRAMbLE-in菌株中存在大量基因组重排，包括26个缺失、36个倒位和32个重复，最大重排长度为1544.17 kb（LWy256的染色体融合）。YBR044C基因缺失与紫色杆菌素产量下降相关，互补实验证实其功能影响。
研究结论
SCRAMbLE-in是一种快速、高效且通用的方法，能够在同一过程中实现外源途径的整合、表达多样化和底盘菌株的基因组进化，显著加速代谢工程的设计-构建-测试循环，为合成生物学与代谢工程的融合提供了新途径。