Cytosolic lipid droplets as engineered organelles for production and accumulation of terpenoid biomaterials in leaves
- 作者
- Radin Sadre, Peiyen Kuo, Jiaxing Chen, Yang Yang, Aparajita Banerjee, Christoph Benning, Bjoern Hamberger
- 单位
- Michigan State University; Great Lakes Bioenergy Research Center
- 杂志
- Nature Communications（2019）
- DOI
- 10.1038/s41467-019-08515-4
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
植物叶片中萜类异源生产产量低且易挥发损失，缺少有效的胞内储存机制，需要工程化脂滴作为合成和储存平台。
研究策略
在本氏烟草瞬时表达体系中，通过共表达截短的WRINKLED1和微藻脂滴表面蛋白NoLDSP增强脂滴积累；同时工程化MEP/MEV途径增加前体供应；将萜类合成酶定位到胞质、质体或通过NoLDSP融合锚定到脂滴表面，实现萜类高效生产并储存于脂滴中。
研究路线图
核心内容
该研究在本氏烟草叶片中构建了工程化脂滴作为萜类化合物的合成与储存平台，以解决植物异源萜类产量低且易挥发的问题。策略上，通过共表达截短的WRINKLED1（AtWRI11-397）和微藻脂滴表面蛋白NoLDSP诱导叶片三酰甘油积累，同时强化MEP/MEV途径前体供给，并将萜类合成酶定位到胞质、质体或通过NoLDSP锚定到脂滴表面。结果显示，AtWRI11-397与NoLDSP共表达使三酰甘油含量较对照提高12倍；质体定位的patchoulol合酶在联合PbDXS和AtFDPS后产量提升60倍，进一步结合脂滴积累最高达约45 μg/g鲜重；二萜合酶AgABS异源表达时，古菌型MtGGDPS效果最佳，共生产脂滴使二萜含量增加2-2.5倍，分离的脂滴中二萜富集达35-460倍。此外，将二萜合酶与细胞色素P450及还原酶共同锚定到脂滴表面，成功实现了二萜树脂酸的级联生产。该工作表明，工程化脂滴既能作为酶固定化平台也能作为萜类储存库，显著提升了叶片中高价值萜类的积累效率，为生物质作物中萜类工业化生产提供了可行策略。
创新点
1. 利用微藻脂滴表面蛋白NoLDSP将萜类合成酶锚定到人为诱导的胞质脂滴表面，实现途径区室化；2. 比较了多种来源和类型的GGDPS，证明异源GGDPS（如古菌型MtGGDPS）可绕过调控瓶颈；3. 证实脂滴对萜类产物有'捕获'作用，显著提高二萜积累；4. 在脂滴表面实现了双功能二萜合酶与细胞色素P450及还原酶的级联反应，生产功能化二萜树脂酸。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 脂肪酸生物合成/三酰甘油合成 | AtWRI1 | WRINKLED1 (AtWRI11-397) | 调控 | AP2/EREBP转录因子，截短体增强稳定性，促进质体脂肪酸合成 |
| Nicotiana benthamiana | 脂滴形成 | NoLDSP | NoLDSP (lipid droplet surface protein) | 区室化 | 来自微藻 Nannochloropsis oceanica 的脂滴表面蛋白，增强脂滴积累并用于融合锚定 |
| Nicotiana benthamiana | 甲羟戊酸(MEV)途径 | ElHMGR | HMG-CoA reductase (ElHMRG159-582) | 催化 | 来自 Euphorbia lathyris 的 HMGR 催化域，反馈不敏感，增强胞质前体 |
| Nicotiana benthamiana | 萜类前体合成（FDP） | AtFDPS | Farnesyl diphosphate synthase (AtFDPS) | 催化 | 来自拟南芥，热稳定性较高，提供FDP |
| Nicotiana benthamiana | 倍半萜生物合成 | PcPAS | Patchoulol synthase (PcPAS) | 催化 | 来自 Pogostemon cablin，催化FDP环化生成广藿香醇 |
| Nicotiana benthamiana | 甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径 | PbDXS | 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (PbDXS) | 催化 | 来自 Plectranthus barbatus，限速酶，增强质体前体 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜前体合成（GGDP） | MtGGDPS | Geranylgeranyl diphosphate synthase (MtGGDPS) | 催化 | 来自 Methanothermobacter thermautotrophicus 的I型GGDPS，增强GGDP供给 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜前体合成（GGDP） | TsGGDPS | Geranylgeranyl diphosphate synthase (TsGGDPS) | 催化 | 来自 Tolypothrix sp. PCC 7601 的II型GGDPS，与MtGGDPS效果相当 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜前体合成（GGDP） | EpGGDPS2 | Geranylgeranyl diphosphate synthase (EpGGDPS2) | 催化 | 来自 Euphorbia peplus 的II型GGDPS，效果与MtGGDPS和TsGGDPS相近 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | AgABS | Abietadiene synthase (AgABS) | 催化 | 来自 Abies grandis，双功能二萜环化酶，催化GGDP生成abietadiene及其异构体 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜树脂酸生物合成 | PsCYP720B4 | Cytochrome P450 (PsCYP720B4) | 催化 | 来自 Picea sitchensis，氧化abietadiene生成树脂酸 |
| Nicotiana benthamiana | 细胞色素P450电子传递 | CaCPR | Cytochrome P450 reductase (CaCPR70-708) | 能量供给 | 来自 Camptotheca acuminata，提供NADPH电子给P450 |
| Nicotiana benthamiana | 脂滴锚定工程 | LD:AgABS85-868 | NoLDSP-AgABS fusion protein | 区室化 | 将AgABS截短体与NoLDSP融合，靶向脂滴表面进行二萜合成 |
关键发现
- AtWRI11-397 与 NoLDSP 共表达使叶片三酰甘油含量较对照提高12倍
- 胞质表达 PcPAS 单独产量很低，加入 ElHMRG159-582 和胞质 AtFDPS 后 patchoulol 提高约5倍
- 质体定位 PcPAS 单独约0.5 μg/g 鲜重，加入 PbDXS 和质体 AtFDPS 后提高60倍，再加入 AtWRI11-397+NoLDSP 最高达约45 μg/g 鲜重
- 质体表达 AgABS 产生约40 μg/g 鲜重二萜烯，共表达 PbDXS 和 GGDPS 最高可提高6.5倍，其中 MtGGDPS、TsGGDPS、EpGGDPS2 效果最佳
- 共生产脂滴使二萜含量增加2-2.5倍，分离的脂滴中二萜含量比对照高35-460倍
- 胞质 AgABS85-868 单独约0.2 μg/g，加入 ElHMRG159-582 和胞质 MtGGDPS 后提高400倍
- 将 AgABS、PsCYP720B4、CaCPR 融合NoLDSP靶向脂滴后，成功生产二萜树脂酸，脂滴靶向PsCYP720B4与内质网定位版本产量相近
- 高产量胞质二萜合成与脂滴结合使三酰甘油降低约50%。
研究结论
通过工程化脂滴积累和萜类前体供给，可在本氏烟草叶片中实现高价值的倍半萜和二萜的高效生产，且脂滴可作为酶锚定平台和萜类储存库，为在生物质作物中工业化生产萜类提供了策略。