The biosynthesis of the odorant 2-methylisoborneol is compartmentalized inside a protein shell
- 作者
- Michael P. Andreas, Tobias W. Giessen
- 杂志
- Nature Communications（2024）
- DOI
- 10.1038/s41467-024-54175-4
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
重新定义链霉菌中EshA的功能，证明其是Family 2B encapsulin外壳蛋白而非转录因子或cAMP结合蛋白，并揭示2-甲基异冰片（2-MIB）这一广泛存在的挥发性萜类化合物的生物合成在蛋白壳内进行区室化。
研究策略
结合生物信息学分析（序列相似性网络、系统发育）、异源表达（在Streptomyces coelicolor和E. coli中）、冷冻电镜（cryo-EM）结构解析、以及多种生化实验（cAMP结合实验、活性测定、差示扫描荧光法）验证Sg Enc的功能和装载机制。
核心内容
该研究重新定义了链霉菌中EshA蛋白的功能，证明其并非此前认为的转录因子或cAMP结合蛋白，而是Family 2B encapsulin外壳蛋白，并揭示了广泛存在的挥发性萜类化合物2-甲基异冰片（2-MIB）的生物合成在蛋白壳内进行区室化。研究者通过生物信息学分析、异源表达、冷冻电镜结构解析及多种生化实验，对来自Streptomyces glaucescens的Sg Enc进行了系统表征。冷冻电镜结果显示，Sg Enc形成直径29.4 nm的T=1二十面体蛋白壳，分别以3.02 Å和2.71 Å的分辨率解析了装载2-MIBS和空壳的结构，每个壳内约装载3-4个2-MIBS二聚体。研究还鉴定出壳上约60×25 Å的大型两倍对称孔，可能利于底物和产物通透。功能实验表明，删除2-MIBS的类胡萝卜素裂解酶结构域会完全消除装载，而该结构域能显著提高装载效率；游离与封装形式的酶活性一致，且Sg Enc确实不结合cAMP。该工作首次实验表征了Family 2B encapsulin系统，确立了蛋白纳米区室参与细菌次级代谢物生物合成的全新范式，为理解2-MIB这一全球最普遍细菌气味分子的产生机制提供了结构基础。
创新点
首次实验表征Family 2B encapsulin系统；发现Sg Enc形成直径29.4 nm的T=1二十面体蛋白壳并封装2-MIBS；鉴定出独特的金属结合结构域（MBD）和表面展示的cAMP结合结构域（CBD）插入；证明CBD不结合cAMP；发现壳上存在大型两倍对称孔（约60×25 Å），可能利于底物/产物通透。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces coelicolor A3(2) | 2-甲基异冰片（2-MIB）生物合成 | Sg Enc | Sg Enc（Family 2B encapsulin外壳蛋白，原EshA） | 区室化 | 形成T=1二十面体蛋白壳（直径29.4 nm），封装2-MIBS货物蛋白，表面展示CBD和MBD结构域。 |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | 2-甲基异冰片（2-MIB）生物合成 | Sg 2-MIBS | 2-甲基异冰片合酶（2-MIBS） | 催化 | 催化2-甲基牻牛儿基焦磷酸（2-MeGPP）环化生成2-MIB；其N端无序CLD介导与壳体结合，每个壳内装载约3-4个二聚体。 |
| E. coli BL21(DE3) | 2-甲基异冰片（2-MIB）生物合成 | Sg MT | S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶（MT） | 催化 | 催化GPP甲基化生成2-MeGPP，为2-MIB生物合成提供底物。 |
| E. coli BL21(DE3) | cAMP信号通路（对照） | Ec CAP | 大肠杆菌分解代谢物激活蛋白（CAP） | 调控 | 作为已知cAMP结合蛋白的阳性对照，用于验证cAMP结合实验的有效性；结果显示Sg Enc不结合cAMP。 |
关键发现
- 在放线菌中鉴定了723个2-MIB生物合成基因簇，其中80%编码Family 2B encapsulin
- Sg Enc形成直径29.4 nm的T=1二十面体壳（60个亚基），cryo-EM分辨率分别为3.02 Å（装载2-MIBS）和2.71 Å（空壳）
- 每个壳内约装载3-4个2-MIBS二聚体（99%颗粒中观察到3-4个内部分隔密度）
- 两倍对称孔尺寸约60×25 Å
- 五倍和三维孔分别约4 Å和2 Å
- Sg Enc的MBD结合Ca2+离子
- 删除2-MIBS的CLD完全消除装载，CLD D（含GPxGxGTxxL保守基序）能显著提高装载效率
- 游离和封装2-MIBS的表观kcat/Km一致，500 μM cAMP不影响活性
- DSF测得Sg Enc两个热转变Tm分别为55.0±0.49°C和70.1±0.17°C，加cAMP后为55.7±2.27°C和70.5±0.33°C
- cAMP-琼脂糖结合实验和cryo-EM均显示Sg Enc不结合cAMP。
研究结论
Sg Enc（原EshA）是Family 2B encapsulin外壳蛋白，以2-MIBS为货物酶，证明2-MIB（一种最普遍的细菌萜类化合物）在多数细菌中的生物合成发生在蛋白壳内部。Sg Enc的CBD不结合cAMP，可能识别其他配体；其独特的金属结合结构域和大型两倍孔可能对壳的结构和功能具有重要意义。本研究重新定义了EshA的功能，并实验确立了Family 2B encapsulin作为参与次级代谢物生物合成的蛋白纳米区室。