Structural insights into the catalytic selectivity of glycosyltransferase SgUGT94-289-3 towards morgosides
- 作者
- Shengrong Cui, Shumeng Zhang, Ning Wang, Xiaodong Su, Zuliang Luo, Xiaojun Ma, Mei Li
- 杂志
- Nature Communications（2024）
- DOI
- 10.1038/s41467-024-50662-w
- 所属领域
- 合成生物学/代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
罗汉果苷生物合成关键酶SgUGT94-289-3对不对称底物罗汉果苷的混杂识别和多种催化模式的结构基础尚不清楚，且高效合成高甜度M5和SIA仍具挑战。
研究策略
综合运用X射线晶体学、酶动力学表征、定点突变和分子动力学模拟，解析SgUGT94-289-3与底物/供体的复合物结构，揭示其双口袋催化机制，并基于结构进行理性设计与改造。
核心内容
该研究以罗汉果苷生物合成关键酶SgUGT94-289-3为对象，针对其底物混杂识别与区域选择性共存的机制不明、高甜度产物M5和SIA合成效率低的问题展开。作者综合利用X射线晶体学、酶动力学、定点突变和分子动力学模拟，解析了包括apo、UDP、M3、M3E等在内的10个晶体结构，首次揭示该酶通过双口袋分别容纳罗汉果苷的R1端和R2端，将不对称底物的两个反应端导向同一活性位点，从而实现底物混杂性与严格区域选择性的统一，并鉴定Nα6-Nα8为关键结构基序。动力学数据显示酶对R1端底物的kcat/Km高于R2端底物，MD模拟显示M3E的6-OH向供体糖移动4.3Å并接近催化残基H22。基于结构设计的突变体V148M/G152A在体外一锅反应中M5产量达94%、副产物仅3%，G152A对M3和SIA的催化效率分别提高11.57倍和368.22倍。该工作阐明了植物糖基转移酶双口袋催化机制，并为罗汉果苷高效生物合成提供了理性工程策略。
创新点
首次揭示SgUGT94-289-3采用双口袋（pocket 1和pocket 2）分别容纳罗汉果苷的R1端和R2端，实现底物混杂性与严格区域选择性的统一；鉴定Nα6-Nα8区域为关键结构基序；通过结构导向工程获得了高产M5/SIA的突变体。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta (DE3) | 罗汉果苷生物合成途径 | SgUGT94-289-3 | SgUGT94-289-3（野生型及突变体） | 催化 | 催化罗汉果苷M2E至M5的连续糖基化，包括β(1-6)和β(1-2)糖苷键形成 |
关键发现
- SgUGT94-289-3催化M2E→M3和M3E→SIA的β(1-6)糖基化产物特异性近90%，催化M3→M4A和SIA→M5的β(1-6)糖基化特异性约70%，而催化M4A→M5的β(1-2)糖基化产物占比低于30%
- 对R1端底物（M2E、M3E）的kcat/Km高于R2端底物（M3、SIA）
- 解析了10个晶体结构（包括apo、UPG、UDP、M3、M3E等）
- 关键残基W17A突变完全失活
- MD模拟显示M3E的6-OH向UPG-Glc移动4.3Å并接近催化残基H22（3.5Å）
- 突变体V148M/G152A在体外一锅反应中M5产量达94%，副产物仅3%，V148W/G152A产生43% SIA
- G152A对M3和SIA的催化效率（kcat/Km）分别提高11.57倍和368.22倍。
研究结论
SgUGT94-289-3通过双口袋组织将不对称罗汉果苷的两个反应端分别导向同一活性位点，从而实现底物混杂性和区域选择性；基于结构的突变改造显著提高了M5/SIA的合成效率，为植物UGT的理性工程提供了新策略。