Divergent multifunctional P450s-empowered biosynthesis of bioactive triterifordin and cryptic asterenoids in Aconitum implies convergent evolution
- 作者
- Fei Luo, Qian Zhou, Feilong Chen, Xinyu Liu, Tsan-Yu Chiu, Guo-Yuan Zhu, Ancheng C. Huang
- 杂志
- Nature Communications（2025）
- DOI
- 10.1038/s41467-025-61188-0
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
乌头属植物中催化ent-kaurene和ent-atiserene骨架氧化的多功能P450酶尚未被鉴定，其驱动二萜结构多样化的机制不清楚。
研究策略
对A. carmichaelii和A. coreanum进行转录组测序与从头组装，通过共表达网络分析（SOM和Pearson系数）挖掘TPS和P450候选基因，在烟草叶片中瞬时表达进行功能验证，利用组合生物合成合成二萜化合物，结合NMR解析产物结构，并通过定点突变和分子对接揭示关键氨基酸。
核心内容
本研究通过对乌头属两种植物（Aconitum carmichaelii 和 A. coreanum）的转录组测序与共表达网络分析，系统鉴定了9个萜烯合成酶和14个细胞色素P450氧化酶，其中8个P450为多功能酶，可氧化ent-kaurene和ent-atiserene骨架的7个不同碳位点（C3、C15至C20）。在烟草叶片中瞬时表达验证功能后，利用组合生物合成成功合成了18个氧化产物，其中14个为新atiserenoids，并首次发现CYP93A和CYP82C亚家族参与LRD骨架氧化。通过定点突变AcoCYP93A1的I404关键残基，C3羟基化产物产量较野生型提高约2.4至3.6倍。研究还在A. coreanum块茎中检测到天然triterifordin，含量约1.2 mg/g干重，并发现5种atiserenoids及triterifordin具有抑制拟南芥根生长的化感活性。该工作揭示了乌头属多功能P450驱动二萜结构多样化的分子机制，为活性二萜的合成生物学制造提供了关键酶工具，同时支持triterifordin生物合成的趋同进化假说。
创新点
1) 系统鉴定出14个P450，其中8个为多功能酶，可氧化7个不同碳位点；2) 首次发现CYP93A和CYP82C亚家族参与LRD骨架氧化；3) 实现triterifordin和14种新atiserenoids的组合生物合成；4) 发现乌头中天然存在triterifordin并揭示趋同进化；5) 通过单点突变可调控P450产物特异性和产量。
研究对象（24）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 乌头（Aconitum carmichaelii） | 二萜生物合成 | AcaCPS | AcaCPS | 催化 | ent-CPP合酶，催化GGPP环化生成ent-CPP |
| 乌头（Aconitum coreanum） | 二萜生物合成 | AcoTPS4 | AcoTPS4 | 催化 | ent-CPP合酶，催化GGPP环化生成ent-CPP |
| 乌头（Aconitum coreanum） | 二萜生物合成 | AcoTPS5 | AcoTPS5 | 催化 | ent-CPP合酶，催化GGPP环化生成ent-CPP |
| 乌头（Aconitum coreanum） | 二萜生物合成 | AcoTPS1 (AcoAS1) | AcoTPS1 | 催化 | ent-atiserene合酶，产生ent-atiserene |
| 乌头（Aconitum coreanum） | 二萜生物合成 | AcoTPS11 (AcoAS2) | AcoTPS11 | 催化 | ent-atiserene合酶，产生ent-atiserene |
| 乌头（Aconitum carmichaelii） | 二萜生物合成 | AcaTPS3 | AcaTPS3 | 催化 | 同时具有atiserene和kaurene合酶活性 |
| 乌头（Aconitum carmichaelii） | 二萜生物合成 | AcaTPS4 (AcaAS1) | AcaTPS4 | 催化 | ent-atiserene合酶，产生ent-atiserene |
| 乌头（Aconitum carmichaelii） | 二萜生物合成 | AcaTPS5 | AcaTPS5 | 催化 | 同时具有atiserene和kaurene合酶活性 |
| 乌头（Aconitum carmichaelii） | 二萜生物合成 | AcaTPS8 (AcaKS) | AcaTPS8 | 催化 | ent-kaurene合酶，产生ent-kaurene |
| 乌头（Aconitum coreanum） | 二萜生物合成 | AcoTPS3 | AcoTPS3 | 催化 | 16α-羟基-ent-kaurene合酶，产生16α-羟基-ent-kaurene |
| 鞘蕊花（Coleus forskohlii） | MEP途径 | CfDXS | CfDXS | 催化 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶，MEP途径限速酶，增强二萜前体供给 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | 二萜生物合成 | AtGGPS | AtGGPS | 催化 | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶，提供GGPP底物 |
| 乌头（Aconitum coreanum） | 二萜生物合成 | AcoCYP82C1 | AcoCYP82C1 | 催化 | 仅氧化ent-kaurene，生成kaurenoid产物 |
| 乌头（Aconitum carmichaelii） | 二萜生物合成 | AcaCYP82C1 | AcaCYP82C1 | 催化 | 仅氧化ent-kaurene，生成kaurenoid产物 |
| 乌头（Aconitum coreanum） | 二萜生物合成 | AcoCYP93A1 | AcoCYP93A1 | 催化 | 多功能P450，氧化ent-atiserene的C3、C6、C7位，产物多样 |
| 乌头（Aconitum carmichaelii） | 二萜生物合成 | AcaCYP93A1 | AcaCYP93A1 | 催化 | 多功能P450，氧化ent-atiserene的C3、C6、C7位 |
| 乌头（Aconitum carmichaelii） | 二萜生物合成 | AcaCYP71A1 | AcaCYP71A1 | 催化 | C20氧化酶，可将C20甲基氧化为醇或醛 |
| 乌头（Aconitum coreanum） | 二萜生物合成 | AcoCYP71A1 | AcoCYP71A1 | 催化 | C20氧化酶，与AcaCYP71A1同源 |
| 乌头（Aconitum coreanum） | 二萜生物合成 | AcoCYP72SA1 | AcoCYP72SA1 | 催化 | 多功能P450，氧化ent-atiserene的多个位点（C3、C7、C13等） |
| 乌头（Aconitum coreanum） | 二萜生物合成 | AcoCYP716B1 | AcoCYP716B1 | 催化 | 可能催化C18位氧化，与CYP720B亚家族相近 |
| 乌头（Aconitum coreanum） | 二萜生物合成 | AcoCYP72A1 | AcoCYP72A1 | 催化 | 多功能P450，氧化ent-atiserene的C3等位点 |
| 乌头（Aconitum carmichaelii） | 二萜生物合成 | AcaCYP72A1 | AcaCYP72A1 | 催化 | 多功能P450，氧化ent-atiserene的C3等位点 |
| 乌头（Aconitum coreanum） | 二萜生物合成 | AcoCYP701A2 | AcoCYP701A2 | 催化 | C19氧化酶，催化C19甲基氧化 |
| 乌头（Aconitum carmichaelii） | 二萜生物合成 | AcaCYP701A2-1 | AcaCYP701A2-1 | 催化 | C19氧化酶，与AcoCYP701A2同源 |
关键发现
- 从乌头属两个物种中发现9个TPS和14个P450，其中8个P450为多功能，可催化7个不同位点（C3、C15、C16、C17、C18、C19和C20）的氧化
- AcoCYP93A1可氧化3个位点（C3、C6、C7），AcoCYP72SA1可氧化4个位点
- 通过突变AcoCYP93A1的I404等关键残基，C3羟基化产物A10的产量较野生型提高约2.4–3.6倍
- 在A. coreanum块茎中检测到triterifordin，含量约1.2 mg/g干重
- A. carmichaelii根中mesaconitine和hypaconitine含量分别约7.3和12.8 mg/g干重
- 合成了18个氧化产物，其中14个为新化合物
- 5种atiserenoids和triterifordin具有抑制拟南芥根生长的化感活性。
研究结论
本研究揭示了乌头属中多功能P450驱动二萜结构多样化的机制，为合成活性二萜提供了酶工具，并支持triterifordin生物合成的趋同进化。