Cloning and expression analysis of mevalonate kinase and phosphomevalonate kinase genes associated with the MVA pathway in Santalum album
- 作者
- Meiyun Niu, Yuping Xiong, Haifeng Yan, Xinhua Zhang, Yuan Li, Jaime A. Teixeira da Silva, Guohua Ma
- 杂志
- Scientific Reports（2021）
- DOI
- 10.1038/s41598-021-96511-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
檀香（Santalum album）中MVA途径关键酶甲羟戊酸激酶（MK）和磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）基因的克隆、功能鉴定与表达调控机制尚不清楚，本研究旨在克隆并分析这两个基因的结构、功能及表达模式。
研究策略
利用RACE技术从檀香成熟叶片中克隆SaMK和SaPMK全长cDNA；通过生物信息学分析基因结构与保守域；利用拟南芥原生质体进行亚细胞定位；通过酵母MK/PMK缺陷突变体进行功能互补验证；用qRT-PCR分析组织表达谱及甲基茉莉酸（MeJA）诱导表达动态。
核心内容
该研究从檀香中克隆并鉴定了甲羟戊酸（MVA）途径中甲羟戊酸激酶（SaMK）和磷酸甲羟戊酸激酶（SaPMK）两个关键酶基因。通过RACE技术获得全长cDNA，其中SaMK全长1409 bp，编码389个氨基酸，SaPMK全长1679 bp，编码508个氨基酸。生物信息学分析显示两者分别与巴西橡胶树MK及雷公藤等植物PMK具有76%的序列相似性。亚细胞定位实验表明两个蛋白均定位于细胞质。在酵母MK/PMK缺陷突变体中的功能互补实验证实，SaMK和SaPMK均编码具有催化活性的激酶。qRT-PCR表达分析显示SaMK在幼叶中表达量最高，比边材高约7.77倍；SaPMK则在根中表达最高，比幼叶高约5.84倍。在100 μM甲基茉莉酸（MeJA）处理下，两个基因在根、茎、叶中的表达均在12小时达到峰值后下降。该研究首次从檀香中克隆并表征了这两个MVA途径关键酶基因，证实其编码有功能的激酶且受MeJA诱导表达，为理解檀香萜类次生代谢调控和檀香醇生物合成机制提供了分子基础。
创新点
首次从檀香中克隆并表征了SaMK和SaPMK基因；通过酵母功能互补证实两者分别编码有功能的MK和PMK；揭示了两个基因的组织特异性表达及MeJA诱导表达模式。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae YMR208W (ΔERG12) | 甲羟戊酸（MVA）途径 | SaMK | 甲羟戊酸激酶（MK） | 催化 | 酵母MK缺陷突变体功能互补实验，验证SaMK编码功能性MK |
| Saccharomyces cerevisiae YMR220W (ΔERG8) | 甲羟戊酸（MVA）途径 | SaPMK | 磷酸甲羟戊酸激酶（PMK） | 催化 | 酵母PMK缺陷突变体功能互补实验，验证SaPMK编码功能性PMK |
| Arabidopsis thaliana 原生质体 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | SaMK | 甲羟戊酸激酶（MK） | 催化 | 亚细胞定位实验，确认SaMK定位于细胞质 |
| Arabidopsis thaliana 原生质体 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | SaPMK | 磷酸甲羟戊酸激酶（PMK） | 催化 | 亚细胞定位实验，确认SaPMK定位于细胞质 |
关键发现
- SaMK全长cDNA为1409 bp，ORF为1170 bp，编码389个氨基酸
- SaPMK全长cDNA为1679 bp，ORF为1527 bp，编码508个氨基酸。SaMK蛋白分子量41.3 kDa，等电点5.23
- SaPMK蛋白分子量54.6 kDa，等电点5.92。序列同源性分析显示SaMK与巴西橡胶树MK相似性达76%，SaPMK与雷公藤、桑树、巴西橡胶树PMK相似性均达76%。亚细胞定位显示两者均定位于细胞质。酵母功能互补实验中，含pYES2-SaMK的YMR208W和含pYES2-SaPMK的YMR220W能在YPG培养基生长。组织表达分析显示SaMK在幼叶中表达最高，比边材高约7.77倍
- SaPMK在根中表达最高，比幼叶高约5.84倍。100 μM MeJA处理下，两者在根、茎、叶中表达均在12 h达到峰值后下降。
研究结论
成功克隆并鉴定了檀香MVA途径中的SaMK和SaPMK基因，证实其编码具有催化活性的激酶，且受MeJA诱导表达，为进一步研究檀香醇生物合成调控奠定了基础。