Reaction mechanism of the farnesyl pyrophosphate C-methyltransferase towards the biosynthesis of pre-sodorifen pyrophosphate by Serratia plymuthica 4Rx13
- 作者
- Marie Chantal Lemfack, Wolfgang Brandt, Katja Krüger, Alexandra Gurowietz, Jacky Djifack, Jan-Philip Jung, Marius Hopf, Heiko Noack, Björn Junker, Stephan von Reuß, Birgit Piechulla
- 杂志
- Scientific Reports（2021）
- DOI
- 10.1038/s41598-021-82521-9
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
阐明Serratia plymuthica 4Rx13中FPP C-甲基转移酶（FPPMT）催化FPP生成pre-sodorifen焦磷酸（PSPP）的反应机制，包括甲基化与环化步骤的详细过程、中间体结构以及关键氨基酸的作用。
研究策略
结合LC-MS直接检测PSPP中间体，利用Robetta同源建模获得酶蛋白模型，通过半经验量子力学（PM7）和密度泛函理论（DFT）计算模拟催化反应路径，采用圆二色谱（CD）确定PSPP的绝对构型，并通过定点突变（共26个氨基酸突变为丙氨酸）进行实验验证。
核心内容
该研究以Serratia plymuthica 4Rx13中催化法尼基焦磷酸（FPP）生成pre-sodorifen焦磷酸（PSPP）的C-甲基转移酶FPPMT为对象，系统阐明了其甲基化与环化的催化机制。研究者结合LC-MS直接检测到PSPP中间体（m/z 395.1，其碎片较FPP增加14.1 Da），利用同源建模与PM7/DFT量子化学计算模拟反应路径，并通过26个氨基酸的定点突变加以验证。计算结果显示反应经历SN2甲基转移、六元环形成、环丙基中间体及开环重排等步骤，总能量为-9.5 kcal/mol，DFT单点能进一步支持该机制（总能量-19.4 kcal/mol）；圆二色谱确认产物绝对构型为(6R,7S,9S)。突变实验中Y39A、H191A等10个突变体完全失活，鉴定出H191-Y39催化二联体；L239A和C241A保留约20%活性并产生6种新化合物。该研究首次报道了兼具C-甲基化和环化功能的甲基转移酶，揭示了萜类非经典生物合成途径，为拓展萜类结构多样性提供了新思路。
创新点
首次通过LC-MS直接检测并确认了环状异戊二烯焦磷酸中间体PSPP；提出了FPPMT催化FPP甲基化与环化的详细机制，涉及Sn2甲基转移、六元环形成、环丙基中间体及开环重排，并鉴定出H191-Y39催化二联体；确定了PSPP的绝对构型为(6R,7S,9S)，与计算预测一致。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Serratia plymuthica 4Rx13 | sodorifen生物合成 | SOD_c20760 | FPP C-甲基转移酶 (FPPMT) | 催化 | 催化FPP的C10甲基化及环化生成PSPP，需要SAM和Mg2+ |
| Serratia plymuthica 4Rx13 | sodorifen生物合成 | SOD_c20750 | Sodorifen合酶 (SODS) | 催化 | 以PSPP为底物生成sodorifen，不直接利用FPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达体系 | SOD_c20760 | His6-FPPMT | 催化 | 用于表达野生型及突变型FPPMT并纯化 |
| Serratia plymuthica 4Rx13 | sodorifen生物合成 | SOD_c20760 | FPPMT催化二联体 (Y39-H191) | 催化 | Y39和H191构成催化二联体，参与环化中的质子转移，突变后完全失活 |
| Serratia plymuthica 4Rx13 | sodorifen生物合成 | SOD_c20760 | FPPMT活性位点残基 (E42, H45, W46, F56, W306等) | 催化 | E42和H45配位Mg2+，W46/F56/W306形成疏水口袋并稳定碳正离子 |
关键发现
- LC-MS检测到PSPP的理论m/z为395.1，其碳碎片m/z 377.2比FPP的363.1增加14.1 Da，证实额外亚甲基的存在
- PM7计算显示甲基转移步骤活化能为20.5 kcal/mol，形成六元环能量下降-8.4 kcal/mol（活化能3.8 kcal/mol），形成环丙基中间体能量上升+3.5 kcal/mol（活化能16.9 kcal/mol），环丙基开环能量下降-6.8 kcal/mol（活化能22.9 kcal/mol），后续氢迁移能量上升4.6 kcal/mol（活化能19.5 kcal/mol）、甲基迁移能量上升2.0 kcal/mol（活化能17.9 kcal/mol），最终质子化能量下降-7.7 kcal/mol，整个反应总能量为-9.5 kcal/mol
- DFT单点能计算支持该机制，总能量为-19.4 kcal/mol
- CD光谱相似因子为0.9972，确认(6R,7S,9S)构型
- 定点突变中Y39A、E42A、W46A、F56A、H191A、Y61A、N219A、D237A、D272A、W306A完全失活，H45A保留约25%±18%活性，L239A和C241A保留约20%±10%活性，且L239A和C241A产生6种新化合物。
研究结论
FPPMT是首个已知同时催化C-甲基化和环化反应将线性FPP转化为环状PSPP的甲基转移酶，其催化机制与经典萜类环化酶相似但利用H191-Y39催化二联体引导环化级联。该研究揭示了萜类生物合成的非经典途径，为通过非天然底物扩大萜类结构多样性提供了新思路。