高级醇 · 代谢工程文献库

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Increased carvone production in Escherichia coli by balancing limonene conversion enzyme expression via targeted quantification concatamer proteome analysis

作者
Erika Yoshida, Motoki Kojima, Munenori Suzuki, Fumio Matsuda, Kazutaka Shimbo, Akiko Onuki, Yousuke Nishio, Yoshihiro Usuda, Akihiko Kondo, Jun Ishii
杂志
Scientific Reports（2021）
DOI
10.1038/s41598-021-01469-y
所属领域
代谢工程
关键词
CarvoneEscherichia coliMetabolic engineeringProteome analysisQconCAT
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解决的核心问题

在大肠杆菌中从(-)-柠檬烯生物合成(-)-香芹酮时，P450/CPR与CDH酶表达不平衡导致产量低并产生二氢香芹醇和二氢香芹酮等副产物

研究策略

利用QconCAT靶向蛋白质组定量方法测定各途径酶（P450、CPR、CDH）的绝对表达量，确定最佳P450/CDH表达比例，并通过更换质粒拷贝数构建单菌株模拟该最优比例

研究路线图

100%
研究问题：大肠杆菌中P450/CPR与CDH表达失衡，(-)-柠檬烯转化(-)-香芹酮产量低、副产物多
策略：利用QconCAT蛋白质组定量测定途径酶绝对表达量，确定最佳P450/CDH比例
关键改造：更换质粒拷贝数，构建单菌株MpaLc模拟最优P450/CDH比例（降低CDH表达）
结果：全细胞P450活性2.4 mg/L/h/OD600；混合菌株100:1时最优；MpaLc产量44±6.3 mg/L，较初始提升15倍
结论：QconCAT蛋白定量有效指导酶表达平衡优化，显著提高(-)-香芹酮产量（达此前报道约150倍）
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核心内容

该研究针对大肠杆菌中(-)-柠檬烯生物合成(-)-香芹酮时P450/CPR与CDH酶表达不平衡导致产量低且产生副产物的问题，首次将QconCAT靶向蛋白质组定量方法应用于代谢途径改造。研究者通过测定各途径酶的绝对表达量，确定最佳P450/CDH表达比例，并通过更换质粒拷贝数构建单菌株模拟该最优比例。结果显示，混合菌株实验中Mpa:Hc=100:1时香芹酮产量最高且副产物最少，QconCAT定量显示此时P450/CDH=16，而初始菌株MpaHc仅为0.004。最终构建的MpaLc菌株从100 mg/L(-)-柠檬烯产44±6.3 mg/L(-)-香芹酮，产量较初始菌株提升15倍，达到此前报道产量的约150倍。该研究表明QconCAT蛋白质组定量方法可有效指导代谢途径酶表达平衡优化，通过降低CDH表达水平使P450/CDH比例接近最优值，显著提高了全细胞催化生产香芹酮的效率。

创新点

首次将QconCAT蛋白质组定量方法应用于代谢途径的基因工程改造，以定量指导酶表达平衡优化

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) (-)-香芹酮生物合成途径（(-)-limonene → (-)-trans-carveol → (-)-carvone） CYP71D18 cytochrome P450 limonene-6-hydroxylase 催化 来自留兰香（Mentha spicata），催化(-)-柠檬烯羟基化为(-)-反式香芹醇
Escherichia coli BL21(DE3) (-)-香芹酮生物合成途径（P450催化所需电子传递） ATR2 cytochrome P450 reductase 催化 来自拟南芥（Arabidopsis thaliana），为P450提供电子
Escherichia coli BL21(DE3) (-)-香芹酮生物合成途径（(-)-trans-carveol → (-)-carvone） ISPD carveol dehydrogenase (CDH) 催化 来自薄荷（Mentha piperita），催化(-)-反式香芹醇脱氢为(-)-香芹酮；过量表达会生成副产物二氢香芹醇
Escherichia coli BL21(DE3) (-)-香芹酮生物合成途径候选CDH limC carveol dehydrogenase (CDH) from Rhodococcus erythropolis DCL14 催化 来自红串红球菌DCL14，需人工电子受体DCPIP才能催化，故未采用
Escherichia coli BL21(DE3) 副产物形成途径（(-)-carvone → dihydrocarvone） 未知内源基因 未知内源酶 催化 野生型大肠杆菌可将(-)-香芹酮还原为二氢香芹酮导致副产物

关键发现

  1. Mpa菌株（P450/CPR）全细胞P450活性为2.4 mg/L/h/OD600
  2. 混合菌株实验中Mpa:Hc=100:1时香芹酮产量最高且副产物最少
  3. QconCAT定量显示MpaHc菌株P450/CDH=0.004，Mpa与Hc 100:1混合时P450/CDH=16
  4. 最终构建的MpaLc菌株从100 mg/L(-)-柠檬烯产44±6.3 mg/L(-)-香芹酮，而初始菌株MpaHc仅产2.9±0.79 mg/L，产量提升15倍，并达到此前报道产量的约150倍

研究结论

QconCAT蛋白质组定量方法可有效指导代谢途径酶表达平衡的优化，通过降低CDH表达水平使P450/CDH比例接近最优值，显著提高了大肠杆菌全细胞催化(-)-柠檬烯生产(-)-香芹酮的产量