Chromosomal engineering of inducible isopropanol- butanol- ethanol production in Clostridium acetobutlicum
- 作者
- Bunmi B. Omorotionmwan, Hengzheng Wang, Jonathan P. Baker, Krzysztof Gizynski, Minyeong Yoo, Cynthia Akaluka, Ying Zhang, Nigel P. Minton
- 单位
- Clostridia Research Group, BBSRC/EPSRC Synthetic Biotechnology Research Centre (SBRC), Biodiscovery Institute, School of Life Sciences, The University of Nottingham, Nottingham, United Kingdom; NIHH Nottingham Biomedical Research Centre, Nottingham University Hospitals NHS Trust and the University of Nottingham, Nottingham, United Kingdom
- 杂志
- Frontiers in Bioengineering and Biotechnology（2023）
- DOI
- 10.3389/fbioe.2023.1218099
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在丙酮丁醇梭菌中实现稳定的染色体整合型异丙醇-丁醇-乙醇(IBE)生产，避免质粒不稳定和抗生素依赖，同时需要可诱导地协调控制分散于多个染色体位点的异源基因。
研究策略
构建多重营养缺陷型菌株(pyrE、argH、purD、pheA)，利用等位基因偶联交换(ACE)将异源基因稳定整合到不同染色体位点，并使用乳糖诱导的正交sigma因子TcdR系统统一调控分散的基因表达。
核心内容
该研究针对丙酮丁醇梭菌中异源基因依赖质粒表达时不稳定且需抗生素筛选的问题，开发了一套染色体整合型可诱导IBE生产系统。通过构建pyrE、argH、purD和pheA四重营养缺陷型菌株，利用等位基因偶联交换将丙酮和异丙醇合成途径基因稳定整合至不同染色体位点，并引入乳糖诱导的正交sigma因子TcdR系统统一调控分散的多个基因表达。实验中还开发了基于dif/ran重复序列的自杀敲除载体，实现无痕框内删除。结果显示，优化后的转化效率达6.41E+06 cfu/μg，较原方案提升约三个数量级；TcdR系统调控下的catP表达水平达2209 units/mg蛋白，比直接使用bgaR启动子高10倍以上。整合丙酮操纵子的菌株在10 mM乳糖诱导下丙酮产量为9.31 g/L，较野生型提高41%；引入sadh后，诱导条件下产生4.4 g/L异丙醇和19.8 g/L IBE混合物，而未诱导时异丙醇仅0.39 g/L。该工作证明利用多重营养缺陷位点和正交sigma因子可稳定协调多基因表达，为梭菌中无质粒代谢工程提供了有效方案。
创新点
1) 开发了新型自杀敲除载体pMTL-KG146/147，利用dif/ran重复序列实现无痕框内删除，可直接选择双交换突变体；2) 将ACE整合位点扩展至purD、argH、pheA三个新位点；3) 构建了乳糖诱导的正交TcdR表达系统，实现对多个染色体位点基因的同步调控。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丙酮/异丙醇合成途径 | ctfA/B, adc | CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶 | 催化 | 整合于purD位点，受PtcdB启动子控制，用于丙酮合成 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丙酮/异丙醇合成途径 | sadh | 次级醇脱氢酶 | 催化 | 整合于pheA位点，受PtcdB启动子控制，来自Clostridium beijerinckii，用于将丙酮转化为异丙醇 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 异源基因表达调控 | tcdR | TcdR sigma因子 | 调控 | 整合于pyrE位点，受bgaR::Pbgal乳糖诱导系统控制，特异性识别PtcdB启动子 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 异源基因表达调控 | bgaR | BgaR响应调节因子 | 调控 | 来自Clostridium perfringens的乳糖诱导转录激活因子，结合乳糖后激活Pbgal启动子 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 嘧啶生物合成 | pyrE | 乳清酸磷酸核糖转移酶 | 催化 | ACE整合位点，缺失导致尿嘧啶营养缺陷，用于tcdR的整合 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 嘌呤生物合成 | purD | 磷酸核糖胺-甘氨酸连接酶 | 催化 | ACE整合位点，缺失导致嘌呤营养缺陷，用于丙酮操纵子的整合 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 苯丙氨酸生物合成 | pheA | 预苯酸脱水酶 | 催化 | ACE整合位点，缺失导致苯丙氨酸营养缺陷，用于sadh基因的整合 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 精氨酸生物合成 | argH | 精氨基琥珀酸裂解酶 | 催化 | ACE整合位点，缺失导致精氨酸营养缺陷，本研究中用于构建多重营养缺陷型 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 基因敲除系统 | codA, catP, pyrE | 胞嘧啶脱氨酶、氯霉素乙酰转移酶、乳清酸磷酸核糖转移酶 | 催化 | 自杀敲除载体pMTL-KG146/147中的选择标记，用于基因缺失突变体的构建 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 报告基因表达 | catP | 氯霉素乙酰转移酶 | 催化 | 作为报告基因，用于评估TcdR正交系统和不同启动子的表达强度 |
关键发现
优化后的转化效率达到6.41E+06 cfu/μg，相比原方案提高约3个数量级。在10 mM乳糖诱导下，经TcdR正交系统调控的catP表达水平(2209 units/mg蛋白)比直接使用bgaR::Pbgal(195 units/mg)高10倍以上，比强启动子PfdX(933 units/mg)高约2.4倍。整合丙酮操纵子的菌株824BO2在10 mM乳糖诱导下丙酮产量达9.31±0.30 g/L，较野生型5.48±0.03 g/L提高约41%。含sadh的菌株824BO3经诱导后产生4.4 g/L异丙醇和19.8 g/L IBE混合物，而未诱导时异丙醇仅0.39 g/L。
研究结论
成功建立了基于多重营养缺陷型位点的染色体整合系统，利用乳糖诱导的TcdR正交sigma因子可同时控制分散于不同染色体位点的基因，实现了4.4 g/L异丙醇和19.8 g/L IBE的生产，超过了先前报道的染色体工程菌株水平。