高级醇 · 代谢工程文献库

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Improved production of recombinant β-mannanase (TaMan5) in Pichia pastoris and its synergistic degradation of lignocellulosic biomass

作者
Fengzhen Zheng, Abdul Basit, Zhiyue Zhang, Huan Zhuang, Jun Chen, Jianfen Zhang
单位
College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren University, Hangzhou, China; Department of Microbiology, University of Jiang, Jiang, Pakistan; Department of ENT and Head and Neck Surgery, The Children's Hospital Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, Zhejiang, China; Interdisciplinary Research Academy, Zhejiang Shuren University, Hangzhou, China
杂志
Frontiers in Bioengineering and Biotechnology（2023）
DOI
10.3389/fbioe.2023.1244772
所属领域
发酵工程
关键词
Trichoderma asperellumcatalysis mechanismimproved productionsynergismtransglycosylationβ-mannanase
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解决的核心问题

提高GH5 β-甘露聚糖酶(TaMan5)在毕赤酵母中的分泌表达量，并阐明其催化机制及在木质纤维素降解中的协同增效作用。

研究策略

利用TaMan5自身的前肽信号肽(propeptide)替换α-factor信号肽，在毕赤酵母中表达重组TaMan5；通过TLC、分子对接和定点突变研究其转糖基化机制；将TaMan5与商业纤维素酶和木聚糖酶组合用于降解玉米秸秆和甘蔗渣。

研究路线图

100%
提高TaMan5在毕赤酵母中的分泌表达量并阐明降解机制
前肽替换α-factor信号肽，构建重组表达菌株
TaMan5自身前肽信号肽替换α-factor信号肽（MGNRALNSMKFFKSQALALLAATSAVA）
表达量提升与生物化学表征：酶活67.5→91.7 U/mL；耐乙醇、耐盐；分子对接与定点突变
转糖基化机制：TLC分析+分子对接+定点突变揭示甘露二糖/低聚糖生成路径
协同降解实验：TaMan5+商业纤维素酶+商业木聚糖酶组合
关键结果：玉米秸秆糖化率43.5%（↑58.8%）；甘蔗渣37.5%（↑42.7%）；比活779.67 U/mg
前肽替换策略显著提高TaMan5表达，协同增效降解木质纤维素
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核心内容

为提高GH5 β-甘露聚糖酶TaMan5在毕赤酵母中的分泌表达，研究者以TaMan5自身前肽信号肽替换α-factor信号肽进行重组表达。结果显示，替换后酶活由67.5 U/mL提升至最高93.56±2.17 U/mL，比活达779.67±18.08 U/mg，为α-factor菌株的1.35倍，且该酶在20%乙醇和15% NaCl存在下仍保持高活性。通过TLC、分子对接及定点突变分析，首次揭示TaMan5在高浓度甘露三糖或甘露四糖条件下可发生转糖基化反应，分别生成甘露四糖或聚合度大于4的甘露低聚糖，这一新机制解释了其将甘露聚糖降解为甘露二糖的催化路径。进一步将TaMan5与商业纤维素酶和木聚糖酶联用处理木质纤维素底物，玉米秸秆糖化水平达43.5%，较单独使用纤维素酶提高58.8%；甘蔗渣糖化水平达37.5%，提高42.7%。该研究通过前肽替换策略有效提升了TaMan5产量，并证明其耐乙醇、耐盐及转糖基化特性可与纤维素酶、木聚糖酶协同增效降解木质纤维素，为低成本生物燃料和高价值生物分子的生产提供了可行方案。

创新点

采用前肽替换策略显著提高TaMan5产量；首次揭示TaMan5通过转糖基化作用将甘露聚糖降解为甘露二糖的新机制；证明TaMan5与纤维素酶/木聚糖酶协同作用可显著提高木质纤维素糖化效率。

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Pichia pastoris 甘露聚糖降解 pman TaMan5 (GH5 β-mannanase) 催化 源自Trichoderma asperellum ND-1，通过前肽替换实现高效分泌表达
Pichia pastoris 分泌表达途径 α-factor信号肽 α-factor 转运 原始信号肽，被TaMan5自身前肽替换以提高蛋白分泌
Pichia pastoris 分泌表达途径 propeptide序列（MGNRALNSMKFFKSQALALLAATSAVA） TaMan5信号肽 转运 替换α-factor后显著提高TaMan5胞外活性
Trichoderma reesei 纤维素降解 纤维素酶基因 纤维素酶（CEL） 催化 商业纤维素酶，用于协同降解木质纤维素
Thermomyces lanuginosus 木聚糖降解 木聚糖酶基因 β-木聚糖酶（XYL） 催化 商业木聚糖酶，与TaMan5协同增效

关键发现

  1. 前肽替换后TaMan5酶活从67.5 U/mL增至91.7 U/mL，最大达93.56±2.17 U/mL，比活779.67±18.08 U/mg，是α-factor菌株的1.35倍
  2. 在20%乙醇和15%NaCl存在下保持高活性
  3. 高浓度甘露三糖或甘露四糖条件下发生转糖基化，分别生成甘露四糖或甘露低聚糖(DP>4)
  4. TaMan5与纤维素酶、木聚糖酶协同作用后，玉米秸秆糖化水平达43.5%（较CEL单独提高58.8%），甘蔗渣达37.5%（较CEL单独提高42.7%）。

研究结论

通过前肽替换策略成功提高了TaMan5在毕赤酵母中的表达，该酶具有耐乙醇、耐盐和转糖基化特性，并能与纤维素酶、木聚糖酶协同增效降解木质纤维素，为低成本生物燃料和高价值生物分子生产提供了可行方案。