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Establishment of CRISPR/Cas9 Genome Editing in Witloof (Cichorium intybus var. foliosum)

作者
Charlotte De Bruyn, Tom Ruttink, Tom Eeckhaut, Thomas Jacobs, Ellen De Keyser, Alain Goossens, Katrijn Van Laere
单位
Plant Sciences Unit, Flanders Research Institute for Agriculture, Fisheries and Food (ILVO), Melle, Belgium; Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent University, Ghent, Belgium; Center for Plant Systems Biology, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Ghent, Belgium
杂志
Frontiers in Genome Editing（2020）
DOI
10.3389/fgeed.2020.604876
所属领域
基因组编辑
关键词
Cichorium intybusHiPlex amplicon sequencinggene editingphytoene desaturaseprotoplast transfectionsesquiterpene lactones
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解决的核心问题

在菊苣（witloof, Cichorium intybus var. foliosum）中建立一套高效的CRISPR/Cas9基因组编辑工作流程，用于靶向倍半萜内酯（SL）生物合成途径基因，从而研究基因功能并改良菊苣的苦味特性。

研究策略

采用PEG介导的原生质体转染将CRISPR/Cas9载体瞬时导入菊苣原生质体，不经选择标记直接再生植株，利用HiPlex扩增子测序对靶位点进行突变分析。

研究路线图

100%
研究问题：在菊苣中建立CRISPR/Cas9编辑体系
策略：原生质体瞬时转染 + 无标记直接再生
构建多靶点CRISPR载体（CiPDS/CiGAS/CiGAO/CiCOS）
PEG介导原生质体转染（效率20%-26%）
CiPDS白化表型23%，验证编辑功能
SL基因突变率：27%-98%，敲除达21%
HiPlex测序揭示多样突变谱（拷贝数多）
结论：成功建立高效编辑流程，服务功能研究与苦味改良
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核心内容

该研究在菊苣品种Van Hamme中建立了基于PEG介导原生质体转染的CRISPR/Cas9基因组编辑工作流程。研究者将靶向倍半萜内酯生物合成途径中CiGAS、CiGAO和CiCOS三个基因的CRISPR/Cas9载体瞬时导入原生质体，不经选择标记直接再生植株，并利用HiPlex扩增子测序分析靶位点突变。结果显示原生质体转染效率为20%—26%；靶向CiPDS的对照实验中，再生植株白化表型频率达23%±3%（55/186）。三个目标基因的植物突变频率分别为27.3%（CiGAS）、42.7%（CiGAO）和98.3%（CiCOS），其中CiGAO基因敲除频率为21.4%，总基因敲除频率为3.6%。ddPCR分析表明CiPDS靶区域至少有4个拷贝，单个白化植株中最多检测到6种不同突变等位基因；CiCOS突变均为同一+1 A插入，而CiGAO则产生20种不同突变类型。该工作流程无需典型选择标记即可高效产生突变和基因敲除，为菊苣基因功能研究及苦味性状改良提供了有效工具。

创新点

首次在witloof中建立了完整的CRISPR/Cas9基因组编辑流程；同时靶向SL途径中三个基因（CiGAS、CiGAO、CiCOS），且无需使用典型植物选择标记即可获得高突变频率；利用HiPlex扩增子测序揭示了不同靶位点差异显著的突变谱。

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
菊苣（Cichorium intybus var. foliosum）品种 Van Hamme 类胡萝卜素生物合成途径 CiPDS 八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase） 催化 靶向第一个外显子，导致白化表型；gRNA靶区域至少4个拷贝。
菊苣（Cichorium intybus var. foliosum）品种 Van Hamme 倍半萜内酯（SL）生物合成途径 CiGAS 大根香叶烯A合酶（germacrene A synthase） 催化 植物突变频率27.3%，共5种突变植物基因型。
菊苣（Cichorium intybus var. foliosum）品种 Van Hamme 倍半萜内酯（SL）生物合成途径 CiGAO 大根香叶烯A氧化酶（germacrene A oxidase） 催化 植物突变频率42.7%，基因敲除频率21.4%，检测到20种突变类型。
菊苣（Cichorium intybus var. foliosum）品种 Van Hamme 倍半萜内酯（SL）生物合成途径 CiCOS 木香烃内酯合酶（costunolide synthase） 催化 植物突变频率98.3%，所有突变均为+1 A插入。
菊苣（Cichorium intybus var. foliosum）品种 Van Hamme CRISPR/Cas9基因组编辑系统 SpCas9 Cas9核酸内切酶 催化 由PEG介导的原生质体转染瞬时表达，结合gRNA在靶位点产生DNA双链断裂。

关键发现

  1. 原生质体转染效率为20%-26%（两个品种）
  2. 靶向CiPDS后，再生植株中白化表型频率为23%±3%（55/186），对照为0%
  3. CiGAS、CiGAO、CiCOS的植物突变频率分别为27.3%、42.7%和98.3%
  4. CiGAO基因敲除频率为21.4%，总植物突变频率为37.9%，总基因敲除频率为3.6%
  5. ddPCR分析显示CiPDS gRNA靶区域至少有4个拷贝（4.54±0.18），在单个二倍体白化植株中最多检测到6种不同CiPDS突变等位基因
  6. CiCOS突变均为同一+1 A插入，CiGAO则检测到20种不同突变类型。

研究结论

成功建立了基于PEG介导原生质体转染和再生系统的菊苣CRISPR/Cas9基因组编辑工作流程，可在多个目标基因中高效产生突变并形成基因敲除，为菊苣基因功能研究和快速改良农艺性状（如苦味）提供了有力工具。