Menadione knocks out Vitreoscilla haemoglobin (VHb): the current evidence for the role of VHb in recombinant Escherichia coli
- 作者
- Suleyman Aydin
- 单位
- Department of Biochemistry and Clinical Biochemistry, Firat University, Medical School (Firat Medical Center), 23119, Elazig, Turkey
- 杂志
- Biotechnology and Applied Biochemistry（2003）
- DOI
- 10.1042/BA20030046
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
验证Vitreoscilla血红蛋白(VHb)在重组大肠杆菌中促进生长和产物生产的作用是否确实由vgb基因编码的活性VHb所致，而非其他Vitreoscilla DNA序列。
研究策略
利用甲萘醌作为氧化剂，将VHb氧化为无活性的高铁形式，比较携带vgb的MK79菌株与不携带vgb的MK57菌株在生长、α-淀粉酶产量、呼吸及VHb含量等方面的差异。
核心内容
该研究通过甲萘醌选择性氧化失活Vitreoscilla血红蛋白（VHb），验证了vgb基因编码的活性VHb在重组大肠杆菌中的直接作用。实验比较了携带vgb的MK79菌株与不携带vgb的MK57菌株在生长和α-淀粉酶生产上的差异。结果显示，在无甲萘醌条件下，MK79的生长和酶产量均优于MK57，16小时D600值分别为2.26和1.92，α-淀粉酶产量分别为1.36和0.98 mg淀粉水解/min/ml。当甲萘醌浓度达到2.5 mM时，MK79的α-淀粉酶产量降至0.86，反而低于MK57的1.02，表明VHb氧化失活后其生产优势消失。甲萘醌对呼吸膜细胞色素活性影响较小，10 mM时氧消耗仅降低10-11%，而MK79全细胞呼吸下降幅度约为MK57的2-3倍。这证实了vgb基因是MK79生长和生产优势的直接原因，活性VHb对增强重组蛋白生产至关重要。这一发现为理解VHb在重组蛋白生产中的作用机制提供了直接证据，也为优化VHb应用提供了新思路。
创新点
首次使用甲萘醌相对选择性地氧化失活VHb，提供了活性VHb直接增强重组蛋白生产的证据。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MK57 | 淀粉水解 | R-amylase gene | α-淀粉酶 | 催化 | 对照组，不含vgb，携带pMK57质粒 |
| Escherichia coli MK79 | 氧利用/呼吸链 | vgb | Vitreoscilla haemoglobin (VHb) | 转运 | 实验组，携带pMK79质粒（含vgb及uvrA片段） |
| Escherichia coli MK79 | 淀粉水解 | R-amylase gene | α-淀粉酶 | 催化 | 同菌株，同时表达α-淀粉酶 |
| Escherichia coli MK57/MK79 | 呼吸链 | — | 细胞色素氧化酶 | 催化 | 甲萘醌对其影响较小，10 mM时RMF活性仅降低10-11% |
关键发现
- 在0 mM甲萘醌下，MK79生长和α-淀粉酶产量均优于MK57：16h生长D600分别为2.26±0.24和1.92±0.16，24h为3.41±0.22和3.1±0.18
- 16h α-淀粉酶产量（mg淀粉水解/min/ml）为1.36±0.04（MK79）对0.98±0.01（MK57），24h为1.74±0.08对1.28±0.05。甲萘醌浓度≥2.5 mM时MK79的α-淀粉酶产量下降，如16h、2.5 mM时MK79为0.86±0.04，MK57为1.02±0.04
- 24h、2.5 mM时MK79为1.06±0.02，MK57为1.16±0.02。甲萘醌使VHb氧化失活，2.5 mM时大部分VHb已无活性，10 mM时24h样品中无活性VHb。甲萘醌对呼吸膜（RMF）细胞色素活性影响小，10 mM时RMF氧消耗仅降低10-11%
- 全细胞呼吸中MK79呼吸下降幅度约为MK57的2-3倍。
研究结论
vgb基因是MK79菌株生长和α-淀粉酶生产优势的直接原因，活性VHb对增强重组蛋白生产至关重要。