Substrate specificity of the expressed carotenoid 3,4-desaturase from Rubrivivax gelatinosus reveals the detailed reaction sequence to spheroidene and spirilloxanthin
- 作者
- Sabine STEIGER, Chantal ASTIER, Gerhard SANDMANN
- 单位
- Biosynthesis Group, Botanical Institute, J. W. Goethe Universität; Centre de Génétique Moléculaire du CNRS (UPR 9061) associé à l'Université Pierre et Marie Curie
- 杂志
- Biochemical Journal（2000）
- DOI
- 10.1042/0264-6021:3490635
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Rubrivivax gelatinosus中类胡萝卜素3,4-脱饱和酶CrtD的底物特异性，从而确定spheroidene和spirilloxanthin分支途径的详细反应顺序。
研究策略
将R. gelatinosus的crtD基因在大肠杆菌中异源表达，制备可溶的活性酶，利用多种结构不同的类胡萝卜素作为底物进行体外酶活测定，并结合酶动力学参数（Km、Vmax）分析底物偏好。
核心内容
将Rubrivivax gelatinosus的类胡萝卜素3,4-脱饱和酶CrtD基因在大肠杆菌中异源表达，获得可溶活性酶后，以多种结构不同的类胡萝卜素为底物进行体外酶活测定。结果证明CrtD是专一的1-羟基类胡萝卜素3,4-脱饱和酶，对1-HO-neurosporene亲和力最高（Km=25 μM），其Vmax/Km约为1-HO-lycopene的3倍，而1,1'-(HO)2-lycopene等底物不能被转化。基于底物偏好性，研究修正了spheroidene合成路线：1-HO-neurosporene先经CrtD脱氢生成demethylspheroidene，再甲基化，而非此前认为的先甲基化后脱氢；同时明确spirilloxanthin合成中1,1'-(HO)2-lycopene为死端产物。这些发现厘清了两个分支途径的详细反应顺序和交叉节点，为类胡萝卜素途径的精准代谢工程改造提供了酶学依据。
创新点
首次通过体外酶学表征揭示了CrtD的底物特异性，证明其是1-羟基类胡萝卜素3,4-脱饱和酶；修正了spheroidene合成中认为3,4-二氢球形烯为中间体的旧观点，提出脱氢先于甲基化的新路线；明确了spirilloxanthin合成中1,1'-(HO)2-lycopene是死端产物，并揭示了两个分支间的连接点。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM101 | 类胡萝卜素生物合成 | crtD | CrtD 3,4-脱饱和酶 | 催化 | 异源表达用于体外酶活性检测和动力学研究 |
| Rubrivivax gelatinosus | spheroidene和spirilloxanthin生物合成 | crtD | CrtD 3,4-脱饱和酶 | 催化 | 野生型中催化C-3,4脱氢；crtD缺失突变体中积累无3,4双键的中间体 |
| Escherichia coli JM101 | 类胡萝卜素生物合成 | crtC | CrtC水合酶 | 催化 | 用于合成1-羟基类胡萝卜素底物，如1-HO-neurosporene和1-HO-lycopene |
| Escherichia coli JM101 | 类胡萝卜素生物合成 | crtF | CrtF甲基转移酶 | 催化 | 用于合成甲氧基类胡萝卜素底物，验证C-1甲氧基化后不能被CrtD作用 |
关键发现
- CrtD最有效底物为1-HO-neurosporene、1-HO-lycopene和1,1'-(HO)2-neurosporene，转化率分别为47%、33%和39%
- Km分别为25 μM、40 μM和19 μM，Vmax分别为1.35、0.69和0.58 nmol·mg蛋白-1·h-1，Vmax/Km（×10^-2）分别为5.4、1.7和3.0
- 3,4-脱饱和反应需要C-1位羟基且对1-HO-neurosporene亲和力最高，是1-HO-lycopene的3倍以上
- 1,1'-(HO)2-lycopene、1,1'-(HO)2-ζ-胡萝卜素、1-CH3O-neurosporene、1'-HO-demethylspheroidene和demethylspheroidene不能作为底物
- 其他底物如1,1'-(HO)2-3,4-didehydrolycopene、1-CH3O-1'-HO-3,4-didehydrolycopene、1'-HO-3,4-didehydrolycopene、1-HO-ζ-胡萝卜素和1-HO-γ-胡萝卜素的转化率分别为38%、37%、28%、15%和15%
- 酶蛋白占大肠杆菌总蛋白的3%-5%。
研究结论
CrtD是专一的1-羟基类胡萝卜素3,4-脱饱和酶，通过C-1羟基识别底物；spheroidene合成中，1-HO-neurosporene先脱氢生成demethylspheroidene再甲基化，而非先甲基化；spirilloxanthin合成从1-HO-lycopene开始，经1-HO-3,4-didehydrolycopene后分支，1,1'-(HO)2-lycopene因不能被CrtD转化而是死端产物；两个支路在CrtD底物层面具有一定交叉，但spheroidene并非spirilloxanthin的中间体。