高级醇 · 代谢工程文献库

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Enzymatic C-4 deacetylation of 10-deacetylbaccalin III

作者
Ronald L. Hanson, William L. Parker, Ramesh N. Patel
单位
Department of Process Research and Development, Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, One Squibb Drive, New Brunswick, NJ 08903, U.S.A.
杂志
Biotechnology and Applied Biochemistry（2006）
DOI
10.1042/BA20060073
所属领域
生物催化
关键词
10-deacetylbaccatin IIIC-4 deacetylaseRhodococcusStenotrophomonas maltophiliabiotransformationpaclitaxel
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解决的核心问题

寻找能特异性去除紫杉烷类化合物C-4乙酰基的酶，为合成C-4修饰的紫杉醇类似物提供关键中间体。

研究策略

以10-脱乙酰巴卡亭III（10-DAB）为唯一碳源从土壤中富集筛选微生物，通过HPLC检测脱乙酰活性，进一步分离纯化目标酶。

研究路线图

100%
研究问题：筛选特异性水解10-DAB C-4乙酰基的酶
策略：以10-DAB为唯一碳源富集筛选微生物
关键发现：分离红球菌ATCC 202191/202192及S. maltophilia SC16447
核心改造：纯化C-4脱乙酰酶218倍并表征（49 kDa，pH 7.5，40°C）
结果：全细胞转化10-DAB产率90%；制备实验HPLC产率85%
结论：获得特异性C-4脱乙酰酶，可用于C-4修饰紫杉醇类似物制备
酶底物特异性：仅水解10-DAB，对紫杉醇/巴卡亭III无活性（Km=0.14 mM）
筛选260个菌落：17株产4,10-DDAB，5株经LC/MS确认（均为S. maltophilia）
制备实验：200 mg 10-DAB经20 g细胞转化→42.8 mg固体，含39.2 mg 4,10-DDAB（95.6%回收率）
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核心内容

本研究以10-脱乙酰巴卡亭III（10-DAB）为唯一碳源，从土壤中富集筛选具有C-4脱乙酰活性的微生物，旨在获得能特异性去除紫杉烷类C-4乙酰基的酶，为C-4修饰紫杉醇类似物的合成提供关键中间体。通过HPLC检测脱乙酰活性并分离纯化目标酶，首次从土壤中分离到两株红球菌（ATCC 202191和202192）及一株可溶性C-4脱乙酰酶产生菌S. maltophilia SC16447。红球菌全细胞可将10-DAB转化为4,10-DDAB，产率达90%，并能从巴卡亭III经10-脱乙酰中间体生成4,10-DDAB，但对紫杉醇无活性。从S. maltophilia SC16447中纯化C-4脱乙酰酶约218倍，SDS-PAGE显示分子量约49 kDa，最适温度40°C、最适pH约7.5，对10-DAB的表观Km为0.14 mM。制备实验中，200 mg 10-DAB经20 g细胞转化，HPLC产率85%，分离得到42.8 mg固体，其中含39.2 mg 4,10-DDAB（回收率95.6%）。该酶底物特异性仅限于10-DAB，不能水解紫杉醇或巴卡亭III的C-4乙酸酯，提示其可用于制备C-4修饰紫杉醇类似物，但底物谱较窄。

创新点

首次从土壤中分离到具有10-DAB C-4脱乙酰活性的红球菌菌株（ATCC 202191和202192）以及可溶性C-4脱乙酰酶产生菌S. maltophilia SC16447；将酶纯化约218倍并进行了生化表征。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Rhodococcus sp. ATCC 202191 10-DAB C-4脱乙酰化 — C-4脱乙酰酶（细胞结合） 催化 全细胞转化10-DAB生成4,10-DDAB，产率90%
Rhodococcus sp. ATCC 202192 10-DAB C-4脱乙酰化 — C-4脱乙酰酶（细胞结合） 催化 全细胞转化10-DAB生成4,10-DDAB，产率90%
Stenotrophomonas maltophilia SC16447 10-DAB C-4脱乙酰化 — C-4脱乙酰酶（可溶性） 催化 纯化218倍，分子量约49 kDa，最适温度40°C，最适pH约7.5，Km=0.14 mM

关键发现

  1. 两株红球菌（ATCC 202191和202192）全细胞可将10-DAB转化为4,10-DDAB，产率90%
  2. 红球菌还能从巴卡亭III经10-脱乙酰中间体生成4,10-DDAB，但对紫杉醇和10-脱乙酰紫杉醇无活性。筛选260个菌落得到17株产4,10-DDAB的菌株，其中5株经LC/MS确认，均为S. maltophilia变异株。从S. maltophilia SC16447中纯化C-4脱乙酰酶218倍，SDS-PAGE显示分子量约49 kDa
  3. 酶最适温度40°C，最适pH约7.5，对10-DAB表观Km为0.14 mM。制备实验中，200 mg 10-DAB经20 g细胞转化，HPLC产率85%
  4. 分离得到42.8 mg固体，含39.2 mg 4,10-DDAB（95.6%回收率）和3.6 mg 7-差向异构体（8.5%）。酶的底物特异性仅限于10-DAB，不能水解紫杉醇或巴卡亭III的C-4乙酸酯。

研究结论

本研究分离并纯化了一种能特异性水解10-DAB C-4乙酰基的酶，该酶可用于制备C-4修饰的紫杉醇类似物，但底物谱较窄，仅对10-DAB有效。