Enantioselective microbial synthesis of the indigenous natural product (-)-α-bisabolol by a sesquiterpene synthase from chamomile (Matricaria recutita)
- 作者
- Young-Jin Son, Moonhyuk Kwon, Dae-Kyun Ro, Soo-Un Kim
- 单位
- Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University; Department of Biological Sciences, University of Calgary; School of Gardening and Horticulture, Yangtze University
- 杂志
- Biochemical Journal（2014）
- DOI
- 10.1042/BJ20140306
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
(-)-α-红没药醇的现有供应方式（巴西坎德拉树蒸馏和化学合成）存在可持续性差和异构体杂质问题，需要一种可持续、高光学纯度的生物合成方法。
研究策略
利用洋甘菊转录组测序数据挖掘候选倍半萜合酶基因，通过酵母体内活性筛选鉴定出(-)-α-红没药醇合酶(MrBBS)，并在酵母和烟草中异源表达实现产物合成；结合NMR和旋光度分析确定产物立体构型。
核心内容
该研究从洋甘菊转录组中挖掘并鉴定出一个倍半萜合酶基因MrBBS，通过酵母体内功能筛选确认其催化产物为对映体纯的(-)-α-红没药醇。作者将MrBBS在酿酒酵母EPY300中异源表达，利用内源甲羟戊酸途径从法尼基焦磷酸从头合成目标产物，5升培养物中产量达8.1±0.4 mg/L，纯化得到34 mg。在本氏烟草中瞬时表达亦可积累约10 μg/g鲜重。动力学分析显示MrBBS对FPP的Km为3.6 μM，kcat为4.6×10⁻³ s⁻¹，催化产物中超过98%为(-)-α-红没药醇，仅含约2%的β-法尼烯副产物。进一步研究发现，MrBBS的N端23个氨基酸残基并非预测的质体靶向信号，而是对酶活性和稳定性至关重要，缺失该区域导致植物体内产量降低41倍，比活力下降两个数量级。该工作首次报道了能单一合成对映体纯(-)-α-红没药醇的倍半萜合酶，为这一天然产物的可持续生物技术生产提供了新途径，也揭示了合酶N端序列在催化功能中的非典型作用。
创新点
首次鉴定出能合成单一对映体纯(-)-α-红没药醇的倍半萜合酶MrBBS；发现MrBBS的N端23个氨基酸残基对其催化活性和稳定性至关重要，而非预测的质体靶向信号；实现了在微生物和植物中合成(-)-α-红没药醇。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母EPY300 | 甲羟戊酸途径/倍半萜生物合成 | MrBBS (MrTPS1) | (-)-α-红没药醇合酶 (MrBBS) | 催化 | 异源表达MrBBS实现从头合成(-)-α-红没药醇，产量8.1±0.4 mg/L |
| 酿酒酵母EPY300 | 倍半萜生物合成 | MrTPS4, MrTPS6 | bicyclogermacrene合酶, β-法尼烯合酶 | 催化 | 活性筛选中显示分别合成bicyclogermacrene和β-farnesene |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 植物内源异戊二烯途径 | MrBBS | MrBBS | 催化 | 瞬时表达积累约10 μg/g鲜重；GFP定位实验表明MrBBS在细胞质而非质体 |
| 大肠杆菌BL21 CodonPlus-RIL | 异源蛋白表达 | MrBBS（全长、Δ23、Δ52） | 重组MrBBS-His6 | 催化 | 用于体外动力学和截短体功能研究；Δ52无法纯化，Δ23活性显著降低 |
关键发现
- 在酵母EPY300中从FPP从头合成(-)-α-红没药醇，产量为8.1±0.4 mg/L（5升培养物中纯化得到34 mg）
- 在本氏烟草中瞬时表达积累约10 μg/g鲜重
- MrBBS动力学参数Km=3.6 μM FPP，kcat=4.6×10^-3 s^-1
- N端缺失23个氨基酸使植物体内产量降低41倍，比活力降低两个数量级
- MrBBS催化产物中>98%为对映体纯(-)-α-红没药醇，仅含少量β-法尼烯（约2%）
- MrBBS在洋甘菊花序中表达量比叶高24-58倍，且为8个倍半萜合酶转录本中最丰富的。
研究结论
洋甘菊MrBBS是一种能够单一合成对映体纯(-)-α-红没药醇的倍半萜合酶，其N端序列对酶活性至关重要，为(-)-α-红没药醇的可持续生物技术生产提供了新途径。