Identification and characterization of a kunzeal synthase from Thapsia garganica: implications for the biosynthesis of the pharmaceutical thapsigargin
- 作者
- Benjamin Pickel, Damian P. Drew, Tom Manczak, Corinna Weitzel, Henrik T. Simonsen, Dae-Kyun Ro
- 单位
- Department of Biological Sciences, University of Calgary, Calgary, Canada, T2N 1N4; Department of Plant and Environmental Sciences, Faculty of Science, University of Copenhagen, 1871 Frederiksberg, Denmark
- 杂志
- Biochemical Journal（2012）
- DOI
- 10.1042/BJ20120654
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解析 Thapsia garganica 中具有重要药用价值的倍半萜内酯 thapsigargin 的生物合成途径，特别是其早期骨架形成的酶学机制，以期为微生物或植物代谢工程生产 thapsigargin 前体提供基础。
研究策略
对 T. garganica 根进行 454 和 Illumina 深度转录组测序，从中鉴定出两个萜烯合酶基因 TgTPS1 和 TgTPS2；通过在代谢工程酵母（EPY300）中异源表达和体外酶学表征，确定其催化功能，并结合 NMR、质谱及 pH 控制实验鉴定主要产物和阐明产物重排机制。
核心内容
本研究对药用植物Thapsia garganica根进行454和Illumina深度转录组测序，克隆了两个倍半萜合酶基因TgTPS1和TgTPS2。在代谢工程酵母EPY300中异源表达及体外酶学表征发现，TgTPS1主要产生δ-cadinene单一产物，而TgTPS2在未缓冲培养基中产生多达十种萜类，但在pH 6-7缓冲条件下主要产物为kunzeal（6β-hydroxygermacra-1(10),4-diene），表明多数副产物由酸诱导的非酶重排产生。通过NMR、质谱及pH控制实验确定了kunzeal的相对构型（6β-OH, 7α-isopropyl），重组TgTPS2以FPP为底物时Km为2.6 ± 0.4 μM，kcat为0.03 s⁻¹。转录组定量显示TgTPS2在根中高表达（RPB为9.37，约为TgTPS1的3.5倍），与thapsigargin积累相符。这是首次报道kunzeal合酶，结合产物结构和表达证据，TgTPS2很可能是thapsigargin生物合成途径的第一个关键酶，kunzeal可能经环氧化和骨架重排转化为其guaianolide骨架，为微生物或植物代谢工程生产thapsigargin前体奠定基础。
创新点
['首次报道了 kunzeal（6β-hydroxygermacra-1(10),4-diene）合酶 TgTPS2，并阐明其酶学特性。', '发现培养液 pH 对 TgTPS2 产物谱有显著影响，酸性条件可使 kunzeal 非酶重排为 cadinene 型化合物，提示以往多产物萜烯合酶的研究可能受 pH 干扰。', '基于产物结构及相关文献，提出了 kunzeal 经环氧化和骨架重排转化为 thapsigargin 骨架（6,12-guaianolide）的合理生物合成途径。', '利用转录组学和定量表达分析，提供了 TgTPS2 参与 thapsigargin 生物合成的重要证据。']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 EPY300 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸途径 / 倍半萜生物合成 | TgTPS1 | δ-cadinene合酶 (TgTPS1) | 催化 | 在工程酵母中异源表达，催化 FPP 生成 δ-cadinene，为单产物酶。 |
| 酿酒酵母 EPY300 (Saccharomyces cerevisiae) | 倍半萜生物合成 | TgTPS2 | kunzeal合酶 (TgTPS2) | 催化 | 主要产物为 kunzeal（6β-hydroxygermacra-1(10),4-diene），pH 缓冲条件下产物谱稳定，酸性条件下产生非酶重排产物。 |
| 大肠杆菌 BL21-AI (Escherichia coli) | 倍半萜生物合成（体外酶学表征） | TgTPS2 | 重组 His6-TgTPS2 | 催化 | 纯化的重组酶在体外使用 FPP 和 Mg²⁺ 催化生成 kunzeal 及次要产物，Km=2.6 μM，kcat=0.03 s⁻¹。 |
| Thapsia garganica（植物来源） | 倍半萜内酯（thapsigargin）生物合成 | TgTPS2 | kunzeal合酶 (TgTPS2) | 催化 | 根中高表达（RPB=9.37），与 thapsigargin 积累相关，推测参与其生物合成第一步。 |
关键发现
- ['T. garganica 根中 thapsigargin 含量为干重的
- 44%。', '从 454 测序获得的 293434 条 reads 中组装出 39512 个 contigs，最终克隆到两个倍半萜合酶基因 TgTPS1 和 TgTPS2，其氨基酸序列一致性达 89%。', '在酵母中表达 TgTPS1 主要产生 δ-cadinene（单一产物），TgTPS2 在未缓冲培养基（pH 变酸）中产生多达十种萜类，但在 pH 6-7 缓冲条件下主要产物为 kunzeal，表明多数副产物由酸诱导的非酶重排产生。', '通过质谱碎片、保留指数、酸碱不稳定性和 NMR 确定 TgTPS2 的主要产物为 6β-hydroxygermacra-1(10),4-diene（kunzeal），相对构型为 6β-OH, 7α-isopropyl。', '重组 TgTPS2 在体外以 FPP 为底物时，Km 为
- 6 ±
- 4 μM，kcat 为
- 03 s⁻¹，产物谱与缓冲酵母培养一致，主要为 kunzeal，另有少量 germacrene D、bicyclogermacrene 和两个未知微量产物。', '转录组定量分析显示 TgTPS2 的 RPB（每碱基读数）为
- 37，是 TgTPS1（2.71）的约
- 5 倍，且高于多数参比基因，表明 TgTPS2 在根中高表达，与 thapsigargin 积累相符。']
研究结论
TgTPS2 是首次发现的 kunzeal 合酶，催化 FPP 环化生成 kunzeal。该化合物不稳定，酸性条件下可重排为 cadinene 类化合物。结合转录组高表达和结构匹配，TgTPS2 很可能是 thapsigargin 生物合成途径中的第一个关键酶，kunzeal 可能通过环氧化和骨架重排转化为 thapsigargin 的 guaianolide 骨架。本研究为最终实现 thapsigargin 或其前体的微生物/植物代谢工程生产迈出了重要一步。