高级醇 · 代谢工程文献库

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Purification and analysis of proteinase-resistant mutants of recombinant platelet-derived growth factor-BB exhibiting improved biological activity

作者
Anne L. COOK, Patricia M. KIRWIN, Stewart CRAIG, Lindsay J. BAWDEN, Dawn R. GREEN, Michael J. PRICE, Sarah J. RICHARDSON, Anthony FALLON, Alan H. DRUMMOND, R. Mark EDWARDS, John M. CLEMENTS
单位
British Bio-technology Ltd., Watlington Road, Cowley, Oxford OX4 5LY, U.K.
杂志
Biochemical Journal（1992）
DOI
10.1042/bj2810057
所属领域
发酵工程
关键词
KEX2PDGF-BBinositol-lipid turnovermitogenic activityproteinase-resistant mutantyeast expression
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解决的核心问题

重组血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）在酵母中表达时发生部分蛋白酶水解，导致生物活性下降且表达量低。

研究策略

通过定点突变去除PDGF-BB中的蛋白酶切割位点（Arg-32和KEX2位点），构建蛋白酶抗性突变体，并优化表达和纯化工艺。

研究路线图

100%
问题：PDGF-BB在酵母中被蛋白酶水解致活性低
策略：定点突变去除蛋白酶切割位点（Arg-32/KEX2）
关键改造1：合成PDGF-B基因截短至1-109残基
关键改造2：构建[Ser28]/[Pro32]突变体
关键改造3：建立CM/苯基-琼脂糖两步纯化
结果1：表达量提高约5倍（2.72-2.96 μg/ml）
结果2：生物活性显著提升（ED50更低）
结果3：切割消除/减少，纯度>95%
结论：突变体可作为优良生产材料，Ile25-Phe37区参与受体结合
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核心内容

该研究针对重组人血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）在酵母表达系统中因蛋白酶水解导致生物活性下降和产量低的问题，通过定点突变消除内部切割位点以改善表达性能。作者合成了截短至1-109残基的PDGF-B基因，利用酿酒酵母α-因子分泌通路进行表达，鉴定出Arg-32为主要内部切割位点，并构建了Ser28和Pro32两种突变体。结果显示，野生型约有50%的蛋白在Arg-32后被切割，而Ser28突变体切割率降至约10%，Pro32突变体则完全无切割。突变体的表达量从野生型的0.334–0.468 μg/ml提升至2.720–2.960 μg/ml，提高了约5倍；在促有丝分裂活性方面，突变体ED50为0.81–0.85 ng/ml，显著优于野生型的1.95 ng/ml，肌醇脂周转活性也有约2–3倍提升。通过CM-琼脂糖和苯基-琼脂糖两步层析，总回收率约64%，纯度超过95%。该研究证明消除内部切割位点可同时提高产量和活性，并表明Ile-25-Phe-37区域与受体结合密切相关，所获突变体可作为生物学研究和生产应用的良好材料。

创新点

['构建了合成PDGF-B基因并截短至1-109残基，对应成熟B链。', '鉴定Arg-32为主要内部切割位点，通过Ser28和Pro32突变消除或减少切割。', '突变体表达量提高约5倍，且生物活性显著高于野生型。', '建立了高效纯化流程，纯度大于95%。']

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae BJ2168 α-factor分泌通路 MFα1 α因子前导肽 转运 引导PDGF-BB分泌，被Kex2蛋白酶切割释放成熟蛋白
Saccharomyces cerevisiae BJ2168 α-factor分泌通路 KEX2 Kex2蛋白酶 催化 负责切割α因子前导肽及PDGF-BB的Arg-32位点；[Ser28]突变破坏其潜在切割位点
Saccharomyces cerevisiae BJ2168 外源蛋白表达 PDGF-B PDGF-BB 调控 血小板衍生生长因子B链同源二聚体，具有促有丝分裂和肌醇脂周转活性；研究Arg-32突变对其活性的影响

关键发现

  1. ['野生型PDGF-BB约50%在Arg-32后发生内部切割；[Ser28]突变体切割率降至约10%，[Pro32]突变体无切割。', '表达量（e.l.i.s.a.）分别为：PDGF-B(1-160)
  2. 334 μg/ml，PDGF-B(1-109)
  3. 468 μg/ml，[Ser28]
  4. 720 μg/ml，[Pro32]
  5. 960 μg/ml，突变体较野生型提高约5倍。', '促有丝分裂活性ED50：PDGF-BB
  6. 95±0.19 ng/ml，[Ser28]
  7. 85±0.07 ng/ml，[Pro32]
  8. 81±0.08 ng/ml；肌醇脂周转ED50：PDGF-BB
  9. 38±1.17 ng/ml，[Ser28]
  10. 19±0.48 ng/ml，[Pro32]
  11. 42±0.29 ng/ml。', '两步层析（CM-琼脂糖和苯基-琼脂糖）后总回收率约64%，最终产品纯度大于95%。', '纯化后PDGF-BB通过SDS/PAGE显示还原条件下两条带（M_r约14000和10000），对应切割产物。']

研究结论

定点突变消除PDGF-BB内部切割位点能够提高表达量和生物活性，证实Ile-25-Phe-37区域与受体结合相关，突变体可作为生物学研究和生产的优良材料。